Koniugaty peptydowego kwasu nukleinowego (PNA) o zastosowaniu przeciwbakteryjnym

Opracowanie nowych, skutecznych strategii przeciwbakteryjnych stanowi kluczowe zadanie w dobie narastającej antybiotykooporności. Niniejsza rozprawa skupia się na kowalencyjnych koniugatach bazujących na konwencjonalnych antybiotykach, peptydach przeciwdrobnoustrojowych oraz oligonukleotydach o działaniu antysensownym (ASO). Mechanizm działania przeciwbakteryjnych ASO opiera się na komplementarnym parowaniu zasad z wybranymi fragmentami bakteryjnego mRNA, najczęściej kodującego białka kluczowe dla przeżycia bakterii. Prowadzi to do zablokowania translacji, a tym samym zahamowania wzrostu bakterii. Szczególny potencjał w zastosowaniach przeciwbakteryjnych wykazuje peptydowy kwas nukleinowy (PNA), cechujący się niską podatnością na degradację enzymatyczną i dużym powinowactwem do RNA i DNA. Wśród nich najbardziej efektywne są oligomery PNA wyciszające gen acpP kodujący białko przenoszące grupę acylową. Wyzwaniem pozostaje jednak transport PNA do wnętrza komórek bakteryjnych. Dotychczas stosowane nośniki peptydowe cechują się niską stabilnością enzymatyczną, co wymusza poszukiwanie nowych i skutecznych rozwiązań. W niniejszej pracy zbadano wpływ stabilizacji peptydów za pomocą węglowodorowego „zszywania” na ich aktywność przeciwbakteryjną oraz zdolność do transportowania PNA do komórek bakteryjnych. Co więcej, wykorzystując strategię tworzenia koniugatów PNA z niskocząsteczkowymi antybiotykami, sprawdzono hipotezę o ich synergistyczym działaniu. W pierwszej części zaprojektowano i otrzymano amfipatyczne peptydy bogate w reszty lizynowe i leucynowe, których strukturę helikalną ustabilizowano poprzez wewnątrzcząsteczkową cyklizację pomiędzy olefinowymi łańcuchami bocznymi z wykorzystaniem reakcji metatezy olefin. Wprowadzona modyfikacja zwiększyła helikalność zaprojektowanych peptydów, ich oddziaływanie z błonami bakteryjnymi oraz stabilność w ludzkiej surowicy. Otrzymane związki hamowały wzrost bakterii w stężeniach 2 - 4 µM, osiągając efektywność porównywalną do polimyksyny B, stosowanego klinicznie antybiotyku peptydowego. Następnie wybrane peptydy sprawdzono w roli nośników PNA do komórek bakteryjnych. Udowodniono, że rodzaj łącznika pomiędzy komponentami wpływa na aktywność koniugatu. Wykorzystanie peptydu o umiarkowanej aktywności przeciwbakteryjnej - anopliny - potwierdziło, że peptydy przeciwdrobnoustrojowe mogą również pełnić funkcję nośników PNA. Otrzymany koniugat anoplina−PNA wykazał aktywność zbliżoną do wzorcowego koniugatu peptydu (KFF)3K z PNA, hamując wzrost bakterii już w stężeniu 2 - 4 µM. Ponadto wykazano, że silne oddziaływanie stabilizowanych peptydów z błonami bakteryjnymi nie koreluje ze skuteczniejszym transportem PNA do komórek. Równolegle opracowano nowe przeciwbakteryjne hybrydy oparte na PNA i dodatnio naładowanych aminoglikozydach. Poprzez potwierdzenie wyciszania genu reporterowego kodującego białko czerwonej fluorescencji udowodniono, że neomycyna usprawnia transport PNA do bakterii. Co więcej, koniugat neomycyna– PNA zawierający oligomer wyciszający gen acpP, wykazał aktywność przeciwbakteryjną w stężeniu 8 µM względem opornego szczepu bakterii Salmonella. Przeprowadzone badania potwierdziły przydatność chemicznej stabilizacji peptydów aktywnych błonowo w otrzymywaniu skutecznych związków przeciwbakteryjnych oraz wykazały istotny wpływ rodzaju zastosowanego łącznika i metody modyfikacji peptydu na aktywność koniugatów peptyd–PNA. Obiecujące wyniki otrzymane dla koniugatu aminoglikozyd−PNA otwierają drogę do projektowania nowych hybryd łączących antysensowne PNA z konwencjonalnymi antybiotykami.

Developing new, effective antibacterial strategies is of the highest priority in light of increasing antimicrobial resistance. The presented thesis focuses on covalently linked conjugates containing conventional antibiotics, antimicrobial peptides, and antisense oligonucleotides (ASOs). The mechanism of action of ASOs is based on complementary pairing with selected regions of bacterial mRNA, usually encoding proteins essential for bacterial survival, which blocks the translation process, causing the inhibition of bacterial growth. Particularly promising antibacterial ASOs are peptide nucleic acids (PNAs), which exhibit low susceptibility to enzymatic degradation and high affinity to RNA and DNA. PNAs silencing the acpP gene that encodes the acyl carrier protein are especially effective. However, PNA uptake into bacterial cells remains a challenge. Currently used peptide carriers show low enzymatic stability, which necessitates the search for new approaches. In this work, the effects of peptide stabilization by hydrocarbon stapling on their antibacterial activity and ability to transport PNA to bacterial cells were evaluated. Moreover, using the strategy of covalent conjugation of PNA with conventional small molecule antibiotics, the hypothesis of the synergistic action of conjugates consisting of aminoglycosides and PNA was tested. In the first part, lysine-and leucine-rich amphipathic peptides were designed and synthesized. Their helical secondary structures were stabilized by intramolecular cyclization of olefinic side chains using ring-closing metathesis. The introduced modification increased helicity, interactions with bacterial membranes, and stability in human serum. The obtained compounds inhibited the bacterial growth at 2 - 4 µM concentrations, reaching effectiveness comparable to a known peptide antibiotic - polymyxin B. Subsequently, selected peptides were tested as PNA carriers to bacterial cells. It was found that the linker type between components of a conjugate affected the antibacterial activity. The use of anoplin, a moderate antimicrobial peptide, confirmed that antimicrobial peptides can act as PNA transporters. The obtained conjugate anoplin–PNA exhibited similar activity to the model (KFF)3K-PNA conjugate, inhibiting bacterial growth at 2 - 4 µM concentration. Moreover, the obtained results showed that strong interactions between peptides and bacterial membranes did not correlate with more effective PNA uptake. Simultaneously, new PNA-based hybrids with positively charged aminoglycosides were obtained. Silencing of the red fluorescent protein reporter gene confirmed that neomycin facilitated PNA transport. Moreover, the neomycin-PNA conjugate containing an oligomer silencing the acpP gene showed antibacterial activity at 8 µM against a neomycin-resistant Salmonella strain. My research demonstrated the utility of chemical stabilization of membrane active peptides in obtaining effective antibacterial agents and showed the influence of the linker type and peptide stabilization method on the antibacterial activity of peptide PNA conjugates. The promising results for the aminoglycoside–PNA conjugate open the pathway for designing new antisense PNA-based hybrids with other conventional antibiotics.