New expression systems for recombinant genes in Escherichia coli cells using ColE1 type plasmid derivatives

Pozachromosomalne elementy genetyczne, znane jako plazmidy, po raz pierwszy zostały rozpoznane w bakteriach ponad 60 lat temu. Plazmidy występują naturalnie w cytoplazmie wielu komórek bakteryjnych umożliwiając horyzontalny transfer genów, a tym samym adaptację drobnoustrojów do zmieniających się warunków środowiska. Ich najbardziej charakterystyczną cechą jest fizyczna odrębność od chromosomu gospodarza oraz zdolność do trwałego utrzymywania się w komórce i replikowania się w niej w kontrolowany sposób. Plazmidy wykazują zdolność do samodzielnej replikacji w komórce gospodarza niezależnie od chromosomu bakteryjnego dzięki obecności origin replikacji – ori. Takie samodzielne jednostki replikacji, nazwane replikonami, determinują liczbę kopii plazmidu w komórce bakteryjnej. Znanych jest kilka modeli replikacji plazmidów jednak najczęściej występującym jest replikon typu ColE1. Do ekspresji rekombinowanych genów stosuje się najczęściej replikony dające kilka do kilkunastu kopii plazmidu, tak aby nie spowodować zbyt dużego obciążenia metabolizmu komórki. W trakcie mojej pracy doświadczalnej wyizolowano, stworzono mapę restrykcyjną i zsekwencjonowano nowy plazmid pochodzący z dzikiego szczepu Enterobacter agglomerans. Na podstawie przeprowadzonych badań potwierdzono, że plazmid nazwany pIGDM1 jest replikonem typu ColE1 i jest kompatybilny z większością używanych obecnie wektorów plazmidowych. Kolejnym etapem mojej pracy było potwierdzenie, że plazmid pIGDM1 można wykorzystać do konstrukcji nowych wektorów ekspresyjnych. Rezultatem mojej pracy było skonstruowanie szeregu nowych wektorów ekspresyjnych w oparciu o plazmid pIGDM1. Każdy z tych wektorów posiada inny gen oporności na antybiotyk: gen cat niosący oporność na chloramfenikol, gen kan niosący oporność na kanamycynę oraz gen bla niosący oporność na ampicylinę. Dwa z nowo utworzonych wektorów zawierają indukowalny promotor faga T7, trzeci natomiast zawiera konstytutywny promotor pms pochodzący z klinicznego szczepu Klebsiella pneumoniae. Wektory ekspresyjne pochodne plazmidu pIGDM1 są kompatybilne z innymi wektorami powszechnie stosowanymi w biologii molekularnej. Wektory te mogą być również wykorzystane do tworzenia koekspresyjnych systemów służących do nadekspresji jednocześnie kilku genów w komórkach E. coli. Ze względu na stabilne utrzymanie się w komórce gospodarza w hodowli pozbawionej presji antybiotyku wektory te mogą zostać wykorzystane do stworzenia nowych prokariotycznych systemów ekspresyjnych używanych w laboratoriach naukowych lub przemyśle farmaceutycznym. Kolejnym zrealizowanym przeze mnie projektem badawczym była konstrukcja nowego wydajnego systemu ekspresyjnego gospodarz/wektor. Skonstruowano wektor ekspresyjny, nazwany pIBA, będący pochodną plazmidu pBR322. Wektor ten posiada gen oporności na tetracyklinę. Ekspresja genów w wektorze pIBA znajduje się pod kontrolą promotora deoP1P2, który jest negatywnie kontrolowany przez chromosomalne białko represorowe, produkt genu cytR. Aby skutecznie wytwarzać białka pod kontrolą promotora deoP1P2 konieczne było otrzymanie odpowiedniego szczepu gospodarza. W tym celu zmodyfikowano gen cytR w szczepie E. coli CSH50R, usuwając fragment 145 par zasad, co w rezultacie prowadzi do tworzenia niefunkcjonalnego białka represorowego. Skonstruowano również geny czterech analogów insuliny połączonych z genem zmodyfikowanej ludzkiej dysmutazy ponadtlenkowej – SOD. Analogi insuliny różnią się od niezmodyfikowanej insuliny ludzkiej między innymi obecnością dodatkowego aminokwasu, co powoduje wydłużenie sekwencji łańcucha A. Dołączenie pozytywnie naładowanych aminokwasów do sekwencji wpłynęło na zmianę punktu izoelektrycznego otrzymanych analogów z około 5.4 w kierunku bardziej neutralnego, a także ich większą stabilność chemiczną. Przeprowadzone na szczurach testy biologiczne in vivo potwierdziły, że uzyskane analogii insuliny są w pełni aktywne biologiczne i charakteryzują się przedłużonym działaniem.

The extrachromosomal genetic elements, known as plasmids, were first recognized in bacteria more than 60 years ago. Plasmids occur naturally in the cytoplasm of many bacterial cells, enabling horizontal gene transfer and hereby provide adaptation of microorganisms to changing environmental conditions. Plasmids contain genes that, although not affecting the basic metabolism of the bacteria, allow gaining additional phenotypic features such as: antibiotic resistance, toxin and colicin production or decomposition and assimilation of various organic compounds. Natural bacterial plasmids are very stably maintained in their host cells. Their most characteristic feature is the physical separation from the host chromosome and the ability to persist permanently in the cell and replicate in it in a controlled manner. Plasmids show the ability to replicate independently in the host cell regardless of the bacterial chromosome due to the presence of the origin replication region - ori. Such stand-alone replication units, called replicons, determine the number of plasmid copies in a bacterial cell. Several plasmid replication models are known but the most common is ColE1 replicon. During my experimental work, a restriction map was created and a new plasmid derived from the wild Enterobacter agglomerans strain was sequenced. Based on the results of my research, it was confirmed that the plasmid, named pIGDM1, is a ColE1 replicon and is compatible with the majority of plasmid vectors currently used The aim of the next stage of my work was to test if the pIGDM1 plasmid can be used for construction of new expression vectors. The result of my work was the construction of a series of new expression vectors based on the pIGDM1 plasmid. Each of these vectors possesses a different antibiotic resistance gene: the cat gene determining chloramphenicol resistance, the kan gene determining kanamycin resistance, and the bla gene determining ampicillin resistance. Two of the newly created vectors contain the T7 phage inducible promoter, while the third contains the constitutive pms promoter derived from the clinical Klebsiella pneumoniae strain. Expression vectors derived from the pIGDM1 plasmid are compatible with other vectors commonly used in molecular biology. These vectors can also be used to create co-expression systems for overexpressing simultaneously several genes in E. coli cells. Due to stable persistence in the host cell in antibiotic-free culture, these vectors can be used to create new prokaryotic expression systems used in scientific laboratories or the pharmaceutical industry Another research project I carried out was the construction of a new efficient host/vector expression system. An expression vector named pIBA was constructed, derived from plasmid pBR322. This vector has the tetracycline resistance gene. Gene expression in the pIBA vector is under the control of the deoP1P2 promoter, which is negatively controlled by the chromosomal repressor protein, the cytR gene product. To successfully produce proteins under the control of the deoP1P2 promoter, it was necessary to obtain the appropriate host strain. To achieve this, the cytR gene in the E. coli CSH50R strain was modified by removal of the 145 base pair fragment, which resulted in the formation of a non-functional repressor protein. The genes of four insulin analogues linked to the modified human superoxide dismutase – SOD gene were also constructed. Insulin analogs differ from unmodified human insulin, among others, by the presence of an additional amino acid, constituting an extension of the A chain sequence. The addition of a positively charged amino acid to the sequence resulted in a shift of the isoelectric point of the obtained analogs from about 5.4 towards more neutral, as well as their greater chemical stability. Biological tests in vivo on rats confirmed that the obtained insulin analogs are biologically fully-active with prolonged action.