Structural and functional characteristics of Helicobacter pylori HP0231 oxidoreductase

Zmiany potranslacyjne białek decydują często o ich strukturze a tym samym o ich funkcjonalności. Wiele czynników wirulencji licznych bakterii patogennych to białka pozacytoplazmatyczne zawierające więcej niż jedną resztę cysteinową. Dla osiągnięcia właściwej struktury wymagają wprowadzania mostków disiarczkowych pomiędzy grupami –SH reszt cysteinowych. Tak więc ta potranslacyjna modyfikacja często decyduje o patogenności drobnoustrojów.W komórkach bakterii gramujemnych proces wprowadzania mostków disiarczkowych zachodzi w przestrzeni peryplazmatycznej i jest katalizowany przez białka Dsb. HP0231 to unikatowa dimeryczna tiolowa oksydoreduktaza, funkcjonalny odpowiednik monomerycznego DsbA wprowadzającego mostki disiarczkowe do białek substratowych. Początkowo, HP0231 zostało opisane jako białko DsbG. Jednak udział tej proteiny w szlaku utleniania Dsb wykazano w eksperymentach in vivo i potwierdzono w doświadczeniach in vitro.Aby lepiej zrozumieć proces oksydacyjnego zwijania białek H. pylori w prezentowanej rozprawie przeprowadzono eksperymenty mające na celu: (1) poznanie filogenezy białka HP0231, (2) określenie właściwości biochemicznych białka, (3) ustalenie roli kluczowych aminokwasów budujących centrum katalityczne oraz (4) określenie roli domeny dimeryzacyjnej HP0231.Przeprowadzone analizy filogenetyczne wykazały, iż ewolucyjnie domena katalityczna HP0231 jest najbliżej spokrewniona z domeną katalityczną EcDsbG choć posiada motywy typowe dla klasycznych DsbA klasy I (np. EcDsbA). Na poziomie strukturalnym domeny katalityczne zarówno białka HP0231 jak i DsbG są najbardziej zbliżone do domen katalitycznych białek DsbA klasy II (np. MtbDsbA – DsbA Mycobacterium tuberculosis).Przeprowadzone badania właściwości biochemicznych HP0231 wykazały, że HP0231 jest tiolową oksydoreduktazą o aktywności oksydacyjnej posiadającą dodatkowo właściwości białka opiekuńczego (podobnie jak EcDsbC/G), ale bez właściwości izomeryzacyjnych, które są charakterystyczne dla EcDsbC. Poznanie roli domeny dimeryzacyjnej oraz kluczowych aminokwasów motywu katalitycznego wymagało skonstruowania hybrydowych białek, skróconego białka HP0231 (HP0231m) pozbawionego domeny dimeryzacyjnej oraz szczepów kodujących punktowo zmienione HP0231. Następnie przeprowadzono szeroką analizę właściwości in vitro oraz in vivo otrzymanych mutantów.Otrzymane wyniki wskazują, że domena dimeryzacyjna białka HP0231 jest kluczowa dla zachowania jego aktywności w komórkach natywnego gospodarza. Ta nietypowa oksydoreduktaza pełni zarówno funkcje oksydazy wprowadzającej mostki disiarczkowe, jak i białka opiekuńczego. Struktura dimeru nie jest niezbędna dla aktywności HP0231 jako białka opiekuńczego, natomiast proces wprowadzania mostków disiarczkowych w komórkach H. pylori jest warunkowany zarówno przez obecność odpowiedniego motywu katalitycznego jak i przez trzeciorzędową strukturę białka HP0231.

Many proteins contain disulfide bonds that stabilize their tertiary and quaternary structures. In Gram-negative bacteria the process of disulfide bond formation is catalyzed through the action of Dsb proteins. Many virulence factors of pathogenic bacteria require the introduction of disulfide bridges between -SH groups of cysteine residues to achieve proper structure. Thus, this post-translational modification often determines the virulence of microorganisms.DsbA is the crucial enzyme for oxidative folding of extracytoplasmic proteins. The H. pylori proteome does not contain not only “classical” DsbA and DsbB but also DsbC nor DsbD. Our knowledge regarding the H. pylori Dsb system is limited although it was proven that this system plays an important role in colonization process.HP0231 is a unique dimeric oxidoreductase functioning in the oxidizing pathway and is the functional equivalent of EcDsbA. This statement is based on both in vivo and in vitro assays. The recently solved structure of HP0231 showed that HP0231 is a V-shape protein, like EcDsbC and EcDsbG, two proteins functioning in reducing Dsb pathways. However, HP0231 acts as a periplasmic oxidase in H. pylori and E. coli cells despite its structural resemblance to EcDsbG. To gain insight into the H. pylori Dsb system I decided to perform experiments aimed at: (1) phylogenetical analyses of HP0231, (2) determination of the biochemical properties of HP0231, (3) determination of the role of key amino acids building catalytic domain and the role of dimerization domain of HP0231.During analyzing of the evolutionary origin of HP0231, I showed that HP0231 is evolutionarily most closely related to the catalytic domain of DsbG, nevertheless it possesses a catalytic motif typical for canonical DsbA proteins. We found that HP0231 exhibits oxidizing and chaperone activities but no isomerizing activity, even though H. pylori does not contain a classical DsbC. To better understand the functioning of HP0231, I decided to study the relations between its sequence, structure and activity through an extensive analysis of various point mutated and truncated versions of HP0231.Given all the atypical features of HP0231, I asked the questions whether the dimerization domain of EcDsbG can act in combination with the HP0231 catalytic domain, and whether the HP0231 dimerization domain can function with the catalytic domain of class I DsbA. To examine these issues I constructed several fusion proteins and analyzed their properties in in vivo and in vitro tests. The results indicate that the presence of HP0231 dimerization domain is necessary for the proper action of this protein as it ensures contact with HP0231 substrates in H. pylori. Additionally, I showed that HP0231 function is independent on the structure of the catalytic domain. Finally, the obtained data proved that HP0231 chaperone activity is independent of its redox function and the dimeric structure of the protein. Taken together, performed experiments confirmed the previously published data that HP0231 is a unique dimeric oxidoreductase involved in disulfide bond formation and broaden our knowledge about its functioning. HP0231 combines oxidative function characteristic of monomeric DsbA proteins and chaperone activity typical of dimeric Dsb protein. Simultaneously, it lacks the isomerization activity. Those combined untypical attributes result from its evolutionary origin, which is noticeable in the structure of its catalytic domain. Moreover, I demonstrated that the HP0231 dimerization domain is necessary for its interaction with substrates in the native host.