Badanie enzymatycznego utleniania L-DOPY i jej pochodnych metodami izotopowymi

Celem prowadzonych przeze mnie eksperymentów było badanie mechanizmu reakcji utleniania L-DOPY oraz jej pochodnych do dopachromu i odpowiednich aminochromów przy udziale enzymu peroksydazy chrzanowej (HRP, EC 1.11.1.7). Reakcja ta jest pierwszym stadium w syntezie naturalnych pigmentów organizmu – melanin. Do analizy mechanizmu wymienionej reakcji wykorzystałam metodę kinetycznych (KIE) oraz rozpuszczalnikowych (SIE) efektów izotopowych. Skupiłam się na wyznaczeniu efektów izotopowych deuteru za pomocą niekonkurencyjnej metody pomiarów spektrofotometrycznych. Rozprawa doktorska składa się z trzech głównych części: przeglądu literaturowego, badań własnych oraz części eksperymentalnej. Przegląd literaturowy stanowi ogólne zestawienie aktualnego stanu wiedzy literaturowej na temat reakcji utleniania L-DOPY i innych związków z ugrupowaniem katecholowym. Zawarłam tutaj informacje na temat melanin, głównie ich biosyntezy i enzymów biorących w niej udział: peroksydazy chrzanowej (EC 1.11.1.7) oraz tyrozynazy (EC 1.14.18.1). Przedstawiłam ponadto krótki przegląd znanych metod syntezy izotopomerów L-DOPY oraz jej pochodnych, znakowanych izotopami wodoru oraz węgla. Dodatkowo zestawiłam podstawowe informacje na temat zastosowania efektów izotopowych w badaniu mechanizmów reakcji. W Badaniach własnych skupiłam się na metodyce syntez L-DOPY oraz dopaminy i norepinefryny znakowanych izotopami wodoru, głównie 2H. Przedstawiłam badania nad tzw. „syntezą zimną” amin katecholowych i ich pochodnych, pod kątem wykorzystania opracowanych syntez do znakowania amin biogennych za pomocą izotopów węgla. W tej części opisałam eksperymenty nad enzymatyczną syntezą normetanefryny z norepinefryny oraz chemiczną syntezą norepinefryny z 3,4-dihydroksybenzaldehydu i NaCN. W Badaniach własnych opisałam opracowane bądź zoptymalizowane przeze mnie metody syntezy izotopomerów [2’,5’,6’-2H3]-dopaminy oraz [2’,5’,6’-2H3]-, [2’,5’,6’-3H3]- i [2’,5’,6’-2H3/3H3]- i [5’-2H]-L-DOPY. Opisałam również metody otrzymywania izotopomerów [3’,5’-2H2]- i [3’,5’-3H2]-L-tyrozyny, jako prekursorów do dalszych przekształceń w odpowiednie izotopomery L-DOPY. Przedstawiłam tutaj ponadto dane uzyskane w trakcie optymalizacji warunków utleniania związków z ugrupowaniem katecholowym katalizowanego przez HRP. Następnie zaprezentowałam wartości SIE uzyskane w reakcji enzymatycznego utleniania natywnej dopaminy i L-DOPY, a także norepinefryny z dodatkiem i bez dodatku H2O2 oraz izotopomerów: [2’,5’,6’-2H3]-dopaminy, [2’,5’,6’-2H3]-, [5’-2H]-L-DOPY. Wyznaczyłam także KIE w tej samej reakcji dla izotopomerów: [2’,5’,6’-2H3]-dopaminy oraz [2’,5’,6’-2H3]-, [5’-2H]- i [3,3-2H2]-L-DOPY. Część eksperymentalna stanowi zbiór szczegółowych procedur przeprowadzonych syntez oraz metod wyznaczania SIE oraz KIE deuteru za pomocą niekonkurencyjnej metody spektrofotometrycznej. Praca zawiera ponadto analizę i interpretację uzyskanych wyników pod kątem wyjaśnienia mechanizmu reakcji utleniania związków z ugrupowaniem katecholowym katalizowanych przez peroksydazę chrzanową.