Transformation and potential use of sedimentary porphyrins by bacteria inhabiting a kerogen–rich shale rock of the Fore-Sudetic Moncline (Poland)

Znacząca część węgla organicznego (~2,5×1022g) występującego na Ziemi jest zdeponowana w litosferze w postaci kopalnej materii organicznej m.in. w kerogenie i bituminie skał łupkowych. Jednym ze składników kopalnej materii organicznej są porfiryny osadowe zwane geoporfirynami. Porfiryny stanowią grupę heterocyklicznych związków organicznych złożonych z czterech zmodyfikowanych pierścieni pirolu połączonych mostkami metinowymi. Porfiryny osadowe występują wyłącznie w formie kompleksów z jonami różnych metali. Prekursorami geoporfiryn są porfiryny organizmów żyjących w odległych okresach geologicznych, które uległy przemianom w procesie diagenezy. Jednym z największych rezerwuarów porfiryn osadowych jest miedzionośna skała łupkowa Kupferschiefer zlokalizowana na obszarze monokliny przedsudeckiej. Dotychczas w skale łupkowej Kupferschiefer potwierdzono występowanie m.in. oktaetyloporfiryn niklowych, wanadylowych i żelazowych; cylkoalkanoporfiryn wanadylowych i żelazowych, dicykloalkano- i benzocykloalkanoporfiryn żelazowych, oraz etio- i dezoksyloerytroetio porfiryn wanadylowych i żelazowych. Jednym z ważniejszych obszarów badań zajmujących się geochemią geoporfiryn jest ich biotransformacja. Pierwsze badania wykazały, że mikroorganizmy mają niewielki wpływ na zawartość geoporfiryn w bitumach piaskowo-smolistych z basenów Ardmore i Anadarko (Oklahoma, USA), olejów i smół z formacji Phosphoria (Wyoming, USA) oraz piasków roponośnych Alberty. Jednak kolejne badania wskazały na możliwość przemian geoporfiryn przez mikroorganizmy żyjące obecnie na Ziemi, ale mechanizmy i znaczenie tego procesu w metabolizmie drobnoustrojów są nadal nieznane. Porfiryny są obecne również w biosferze. Wiele kofaktorów kluczowych enzymów organizmów żywych to związki tetrapirolowe zawierające skompleksowany jon metalu (Fe2+, Co2+ i Ni2+). Dobrze znanym przykładem są zawierające żelazo hem i sirohem oraz kobalamina zawierająca kobalt. Mikroorganizmy syntetyzują kofaktory tetrapirolowe de novo lub mogą pobierać je ze środowiska. Liczne bakterie nie posiadają niektórych lub wszystkich enzymów potrzebnych do syntezy kofaktorów tetrapirolowych, a większość z nich jest zależna od źródeł egzogennych tych związków. Dobrze znana jest zdolność mikroorganizmów do pobierania kofaktorów tetrapirolowych, takich jak hem czy kobalamina. Wciąż jednak nieznane są możliwości wykorzystania przez mikroorganizmy porfiryn osadowych jako prekursorów do biosyntezy kofaktorów tetrapirolowych. Cele badań: 1. Poznanie roli bakterii zasiedlających skałę łupkową w przemianach wybranych porfiryn niklowych i wanadylowych na przykładzie porfiryn osadowych i syntetycznych z podstawnikami alifatycznymi i aromatycznymi. 2. Poznanie roli bakterii zasiedlających skałę łupkową w przemianach i potencjalnym wykorzystaniu protoporfiryny kobaltowej jako prekursora hemu B na przykładzie porfiryny osadowej i syntetycznej. 3. Kompleksowa charakterystyka szlaków biosyntezy kofaktorów tetrapirolowych (hemu, sirohemu, kobalaminy) oraz uroporfirynogenu III przeprowadzanych przez zespół bakterii zasiedlający skałę łupkową. Aby zrealizować powyższe cele opracowano koncepcję kompleksowych badań terenowych i laboratoryjnych z wykorzystaniem: • geoporfiryn osadowych i syntetycznych; • złożonego zespołu bakterii oraz szczepu Pseudomonas sp. LM27 wyizolowanego z zespołu bakterii; • instrumentalnych technik analitycznych oraz molekularnych W wyniku przeprowadzonych badań wykazano: • Zdolność zespołu bakterii zasiedlających skałę łupkową, w tym szczepu LM27 do biodegradacji niklowych i wanadylowych porfiryn osadowych. • Zdolność szczepu LM27 do degradacji porfiryn osadowych potwierdzono także w eksperymentach laboratoryjnych z wykorzystaniem porfiryn syntetycznych. • Wpływ bakterii zasiedlających skałę łupkową, w tym szczepu LM27 na zawartość osadowej protoporfiryny kobaltowej w skale łupkowej. • Potencjalną zdolność zespołu bakterii zasiedlających skałę łupkową, w tym szczepu LM27 do wewnątrzkomórkowej akumulacji protoporfiryny kobaltowej. Ponadto: • W oparciu o analizę metaproteomów zaproponowano hipotezę, że osadowa protoporfiryna kobaltowa z uwagi na strukturalne podobieństwo do hemu, może być wykorzystana jako źródło pierścienia tetrapirolowego do biosyntezy hemu B. • W oparciu o metadane genomiczne i proteomiczne wykazano niezdolność zespołu bakterii zasiedlającego skałę łupkową do biosyntezy hemu, kobalaminy i ich głównego prekursora uroporfirynogenu III de novo wg znanych obecnie szlaków. Potwierdzono jednak zdolność zespołu bakterii do biosyntezy enzymów zawierających kofaktory tetrapirolowe. • W oparciu o uzyskane wyniki wysunięto hipotezę, że bakterie mogą wykorzystywać pierwotne lub zmodyfikowane porfiryny osadowe oraz produkty ich przemian jako prekursory do syntezy kofaktorów tetrapirolowych. Eksperymentalna weryfikacja tej hipotezy będzie przedmiotem dalszych badań Przedstawiona rozprawa doktorska stanowi pierwsze tak obszerne opracowanie dotyczące porfiryn osadowych. Zrozumienie przemian geoporfiryn występujących w skale łupkowej jest niezwykle trudne ze względu na złożoną budowę tej skały, a także złożone zespoły bakterii, zarówno pod względem składu taksonomicznego, jak i przeprowadzanych procesów metabolicznych. Opracowana koncepcja oparta na badaniach terenowych i laboratoryjnych z wykorzystaniem skały łupkowej oraz porfiryn syntetycznych pozwoliła na wskazanie kluczowych etapów bakteryjnych przemian geoporfiryn. Przedstawione wyniki badań wskazują na udział bakterii w rozkładzie i potencjalnym wykorzystaniu kopalnych geoporfiryn występujących w skale łupkowej Kupferschiefer. Przypuszcza się, że bakteryjna degradacja geoporfiryn może być jednym z czynników wpływających na uruchomienie kopalnego węgla organicznego związanego przez miliony lat w skale osadowej i włączenie go do globalnego obiegu węgla na Ziemi. Proces ten może mieć ogromne znaczenie w skali globalnej ze względu na fakt, że skały łupkowe są jednym z największych rezerwuarów węgla organicznego na Ziemi. Ponadto, bakteryjna degradacja geoporfiryn ma wpływ na obieg niklu i wanadu, które są odłączone od związku organicznego (geoporfiryny), a także żelaza, które jest przyłączane do pierścienia tetrapirolowego. Opisane procesy dostarczają zatem informacji na temat cyklu pierwiastków i pokazują rolę biosfery w tych przemianach, a jednocześnie pokazują potencjalny wpływ litosfery na metabolizm biosfery. Na podstawie uzyskanych wyników opracowano podstawy oryginalnej hipotezy wykorzystania pierwotnych lub zmodyfikowanych porfiryn osadowych lub produktów ich bakteryjnej degradacji jako prekursorów kofaktorów tetrapirolowych. Szczegółowe zrozumienie i potwierdzenie tej hipotezy wymaga jednak dalszych badań.

Much of the organic carbon (~2.5×1022 g) found on Earth is deposited in the lithosphere in the form of fossil organic matter in kerogen and bitumen of shale rocks, among others. Sedimentary porphyrins called geoporphyrins are one of the components of fossil organic matter. Porphyrins are a group of heterocyclic organic compounds composed of four modified pyrrole rings linked by methine bridges. Sedimentary porphyrins occur only in the form with a complexed metal ion. The precursors of geoporphyrins are porphyrins of organisms living in remote geologic periods that were transformed by diagenesis. One of the largest reservoirs of sedimentary porphyrins is the Kupferschiefer copper-bearing shale rock, located in the area of the Sudetic Monocline. The occurrence of, among others, nickel, vanadyl and iron octaethylporphyrins; vanadyl and iron cycloalkanoporphyrins, iron dicycloalkano- and benzocycloalkanoporphyrins, and vanadyl and iron ethio- and deoxyloerythroethio porphyrins has been confirmed so far in the Kupferschiefer shale rock. One of the most important areas of research dealing with the geochemistry of geoporphyrins is their postdiagenetic biotransformation. Early studies showed that microorganisms have little effect on the geoporphyrins content of sandy-silt bitumens from the Ardmore and Anadarko basins (Oklahoma, USA), oils and tars from the Phosphoria Formation (Wyoming, USA), and oil sands of Alberta (Canada). However, subsequent studies have indicated the possibility of transformation of geoporphyrins by microorganisms currently living on Earth, but the mechanisms and significance of this process in microbial metabolism are still unknown. Porphyrins are also present in the biosphere. Many cofactors of key enzymes of living organisms are tetrapyrrole compounds containing a complexed metal ion (Fe2+, Co2+ and Ni2+). A well-known example is iron-containing heme and siroheme and cobalt-containing cobalamin. Microorganisms synthesize tetrapyrrole cofactors de novo or may take them up from the environment. Numerous bacteria lack some or all of the enzymes needed to synthesize tetrapyrrole cofactors, and most are dependent on exogenous sources of these compounds. The ability of microorganisms to take up tetrapyrrole cofactors such as heme or cobalamin is well known. However, the potential for microorganisms to use sedimentary porphyrins as precursors for the biosynthesis of tetrapyrrole cofactors is still unknown. Objectives of the study: 1. Understanding the role of bacterial community inhabiting shale rock in transformation of selected nickel and vanadyl porphyrins on the example of sedimentary and synthetic porphyrins with aliphatic and aromatic substituents. 2. Understanding the role of bacteria inhabiting shale rock in the transformation and potential use of cobalt protoporphyrin as a precursor of heme B on the example of sedimentary and synthetic porphyrin. 3. Comprehensive characterization of biosynthetic pathways of tetrapyrrole cofactors (heme, siroheme, cobalamin) and uroporphyrinogen III carried out by a community of bacteria inhabiting shale rock In order to achieve the above objectives, a concept for a comprehensive field and laboratory study was developed using: • sedimentary and synthetic geoporphyrins; • a bacterial community and a Pseudomonas sp. LM27 strain isolated from a bacterial community; • instrumental analytical and molecular techniques. The results obtained from the work carried out showed: • The ability of a community of bacteria inhabiting the shale rock, including strain LM27, to biodegrade nickel and vanadyl sedimentary porphyrins • The ability of LM27 strain to degrade sedimentary porphyrins was also confirmed in laboratory experiments using synthetic porphyrins. • Bacteria inhabiting shale rock, including LM27 strain, affect sedimentary cobalt protoporphyrin content in shale rock. • The potential ability of a community of bacteria inhabiting shale rock, including LM27 strain, to accumulate cobalt protoporphyrin intracellularly was demonstrated. • Based on metaproteome analysis, a hypothesis was proposed that sedimentary cobalt protoporphyrin, due to its structural similarity to heme, could be used as a source of tetrapyrrole ring for heme B biosynthesis. • Based on genomic and proteomic metadata, the inability of the bacterial community inhabiting the shale rock to biosynthesize heme, cobalamin and their major precursor uroporphyrinogen III de novo according to currently known pathways was demonstrated. However, the ability of the bacterial community to biosynthesize enzymes containing tetrapyrrole cofactors was confirmed. • Based on the results obtained, we hypothesized that bacteria may use primary or modified sedimentary porphyrins and their transformation products as precursors for the synthesis of tetrapyrrole cofactors. Experimental verification of this hypothesis will be the subject of further studies The dissertation presented represents the first such comprehensive study of sedimentary porphyrins. Understanding the transformation of geoporphyrins found in shale rock is extremely difficult due to the complex structure of this rock, as well as the complex bacterial communities, both in terms of taxonomic composition and metabolic processes. The concept developed, based on field and laboratory studies using shale rock and synthetic porphyrins, identified key steps in the bacterial transformation of geoporphyrins. Results presented indicate bacterial involvement in the decomposition and potential utilization of fossil geoporphyrins found in the Kupferschiefer shale rock. It has been speculated that bacterial degradation of geoporphyrins may be one of the factors involved in mobilizing fossil organic carbon bound for millions of years in sedimentary rock and incorporating it into Earth's global carbon cycle. This process could be of great importance on a global scale due to the fact that shale rocks are one of the largest reservoirs of organic carbon on Earth. In addition, bacterial degradation of geoporphyrins affects the cycling of nickel and vanadium, which are dissociated from the organic compound (geoporphyrins), as well as iron, which is attached to the tetrapyrrole ring. The processes described thus provide information on the elemental cycle and show the role of the biosphere in these transformations, while also demonstrating the potential influence of the lithosphere on biosphere metabolism. Based on the results obtained, the basis for an original hypothesis of using primary or modified sedimentary porphyrins or their bacterial degradation products as precursors of tetrapyrrole cofactors was developed. However, detailed understanding and confirmation of this hypothesis requires further studies.