Jedno- i wieloskładnikowe matryce do kontrolowanego unieruchamiania enzymów i nici DNA na różnych podłożach

Dotychczasowe doniesienia literaturowe wskazują, że związki ważne biologicznie, takie jak kwasy nukleinowe i enzymy pozostają elektroaktywne po osadzeniu na materiałach metalicznych i niemetalicznych. Stwarza to szansę ich ilościowej kontroli na powierzchni i monitorowania zmian ich właściwości. Jednakże dokładne i precyzyjne wyizolowanie charakterystycznego sygnału biomolekuły z często złożonego sygnału tła i zapewnienie efektywnej komunikacji elektronowej pomiędzy podłożem a biomolekułą stanowią nadal duże wyzwanie. Zrozumienie mechanizmu przeniesienia elektronu poprzez warstwę pośredniczącą dla związków biologicznie aktywnych może pozwolić na udoskonalenie konstrukcji elektrod enzymatycznych lub biosensorów. Niniejsza rozprawa doktorska dotyczy charakterystyki warstw pośredniczących, umożliwiających kontrolę jakości i orientacji (na powierzchni) związków o dużym znaczeniu biologicznym (DNA, enzymy). Rozprawa doktorska podzielona jest tradycyjnie na dwie części: część literaturową i eksperymentalną. W części literaturowej, składającej się z ośmiu rozdziałów, zostały omówione metody modyfikacji podłoża elektrodowego w wyniku elektorosadzania związków organicznych oraz samoorganizacji warstw tiolowych. Dokonano również charakterystyki hydrożeli polimerowych (ze szczególnym uwzględnieniem hydrożelu pNIPA) uwzględniając ich zastosowanie. W rozdziale 7 omówiono oraz scharakteryzowano materiały kompozytowe, ze szczególnym uwzględnieniem kompozytu polimer przewodzący nanocząstki złota: PPy-(Au Nps). Opisano również budowę i funkcje kwasu deoksyrybonukleinowego (DNA) oraz enzymów wykorzystywanych w niniejszej rozprawie doktorskiej (lakaza, oksydaza glukozowa), a także stosowane w trakcie pracy eksperymentalnej odczynniki oraz użyte techniki badawcze. W swojej pracy doktorskiej skupiłem się na wykorzystaniu soli diazoniowych, hydrożeli oraz kompozytów polimerowych z dodatkiem nanocząstek złota do modyfikacji podłoża. Modyfikację podłoża jednorodną warstwą fenylową uzyskuje się w wyniku jednoelektronowej redukcji soli diazoniowej. Ważnym etapem w procesie osadzenia odpowiednio zmodyfikowanych grup fenylowych jest utworzenie rodnika, za pośrednictwem którego grupa fenylowa łączy się z podłożem. Niestety, głównym mankamentem wykorzystania soli diazoniowych jest niekontrolowany rozrost tworzonej przez nie warstwy, czyli tworzenie struktury wielowarstwowej, która w przypadku związków biologicznie ważnych jest niepożądana. Na podstawie przeprowadzonych badań udowodniono, że wbrew powszechnemu przekonaniu, parametrem limitującym tworzenie mono- czy też wielowarstwy nie jest czas elektroosadzania ale potencjał elektroredukcji. Jeśli przyłożony potencjał był wystarczający do redukcji wszystkich cząsteczek jonu diazoniowego na powierzchni elektrody, wówczas po utworzeniu monowarstwy nie obserwowano jej dalszego rozrostu. Dodatkowo, warstwa taka charakteryzowała się najlepszą regularnością. Potwierdziły to wyniki uzyskane technikami AFM oraz PM IRRAS. Jakość i regularność uzyskanej warstwy fenyloaminowej miała bezpośrednie przełożenie na aktywność unieruchamianych na jej powierzchni nici DNA. Tylko i wyłącznie w przypadku utworzenia monowarstwy wszystkie nici DNA unieruchomione na łączniku fenyloetyloaminowym były zdolne do procesu hybrydyzacji. Badania dotyczące wpływu potencjału elektroredukcji soli diazoniowej na jakość uzyskiwanego filmu fenylowego oraz na jego funkcjonalność względem DNA zostały opisane w publikacji naukowej w czasopismie Analytical Chemistry 83 (2011) 9281. Synteza soli diazoniowych jest etapem czasochłonnym i niestety jej trwałość w temperaturze pokojowej jest bardzo niska. W związku z tym, próbuje się modyfikować podłoża warstwą fenylową w warunkach in situ. Podejście to zdecydowanie skraca czas i minimalizuje koszty badań, jednakże ma swoje wady. Z uwagi na fakt, że sól diazoniowa syntezowana jest na drodze spontanicznej reakcji pomiędzy odpowiednią I-rzędową aromatyczną pochodną aminową i azotanem(III) sodu w środowisku 0.5 M HCl, produkty reakcji ubocznych mogą również adsorbować się na powierzchni elektrody. Udział reakcji ubocznych bezpośrednio przekłada się na stabilność i funkcjonalność takiego filmu. W niniejszej rozprawie doktorskiej wykazano, że w warunkach in situ bardzo ważną rolę odgrywa czas, jaki upłynął od momentu sporządzenia mieszaniny reakcyjnej: I-rzędowa amina aromatyczna + azotan(III) sodu. Udowodniono, że analogicznie jak w warunkach ex situ, wartość potencjału elektroredukcji, jak i odpowiedni stosunek molowy substratów decyduje o jednorodności i grubości uzyskiwanej warstwy fenylowej osadzanej na powierzchni elektrody. Im grubsza jest warstwa, tym bardziej jest ona zróżnicowana pod względem topograficznym. Defekty warstwy w postaci jej nierówności zdecydowanie pogarszają efektywność pracy urządzeń, w których została ona zastosowana m.in. biosensory DNA, jak i bioogniwa. Wykazano, że cienka jednorodna warstwa fenylowa umożliwia unieruchomienie na jej powierzchni pojedynczych nici DNA całkowicie zdolnych do procesu hybrydyzacji, jak również znacznie poprawia wydajność katalityczną enzymu po jego osadzeniu. Warunki uzyskania najcieńszej i najbardziej jednorodnej warstwy fenylowej w warunkach in situ zostały opublikowane w Electrochimica Acta 126 (2014) 11. W celu porównania funkcjonalności podłóż zmodyfikowanych warstwą fenylową uzyskaną w wyniku elektroredukcji odpowiedniej soli diazoniowej oraz warstwą fenylową powstałą w wyniku samoorganizacji tiolowanych cząsteczek przeprowadzono odpowiednie badania. Charakterystyka tak utworzonych warstw wykazała, iż spełniają one funkcje warstw pośredniczących w procesie unieruchomienia związków biologicznie ważnych na podłożu. Jednakże ich jakość ściśle zależy od sposobu ich tworzenia. Na podstawie przeprowadzonych badań (szczególnie wyników uzyskanych z zastosowania spektroskopii impedancyjnej) można stwierdzić, że warstwa fenylowa tworzona na drodze elektroredukcji soli diazoniowej charakteryzuje się dużo większą jednorodnością i stabilnością w czasie w porównaniu do warstwy utworzonej na drodze chemisorpcji; publikacja naukowa w Electroanalysis 24 (2012) 2053. Zastosowanie materiału kompozytowego typu: polimer przewodzący – nanocząstki Au, jak i hydrożelu, zdecydowanie rozwija powierzchnię pracującą podłoża. Może to mieć szczególne znaczenie w poprawie czułości biosensorów DNA, również tych stosowanych w badaniach skażenia żywności czy testów potwierdzających obecność żywności genetycznie modyfikowanej. Granica detekcji biosensora DNA ściśle zależy od efektywności procesu hybrydyzacji i od ilości nici DNA tworzących warstwę sensorową. Im więcej zdolnych do hybrydyzacji nici DNA, tym lepsza czułość danego biosensora. Nanocząstki złota odpowiednio rozłożone w warstwie polimeru powinny stworzyć szczególnie dobre warunki do utworzenia efektywnej warstwy sensorowej. Modyfikację podłoża węgla szklistego kompozytem polipirol – nanocząstki złota można przeprowadzić metodą elektrochemicznej polimeryzacji. Metoda ta, przy zastosowaniu osadzania pulsowego z odpowiednio dobranym potencjałem osadzania, pozwalała uzyskać w miarę jednorodną pozbawioną defektów warstwę polipirolu. W badaniach wykorzystano kompozyt o różnej grubości filmu polimerowego i stałej ilości nanocząstek złota. Metoda impedancyjna pozwoliła zauważyć, że w matrycy kompozytowej (PPy-(Au Nps)) o różnej grubości filmu polipirolowego wartość oporu przeniesienia ładunku (Rct) znacznie się obniżyła w stosunku do czystej warstwy polimeru. Obecność nanostruktur Au w badanej warstwie spowodowała również polepszenie jej przewodnictwa w stosunku do czystego polimeru. Grubość polipirolu w matrycach kompozytowych miała istotny wpływ na strukturę warstwy nanocząstek Au. Wartość oporu przeniesienia ładunku w przypadku kompozytu o najcieńszej warstwie polipirolu (10 nm) była zbliżona do wartości tego parametru dla czystej elektrody, co potwierdza jednorodność badanej warstwy kompozytowej i równomierne rozłożenie w niej nanocząstek Au. Zwiększanie grubości polipirolu w matrycach kompozytowych skutkowało wzrostem Rct. Wzrost grubości polipirolu w badanych warstwach kompozytowych wiązał się także z pogorszeniem ich regularności. Użyteczność kompozytu: polimer przewodzący – (Au Nps) w konstrukcji biosensora DNA została przedstawiona w publikacji naukowej w Electrochimica Acta http://dx.doi.org/10.1016/j.electacta.2014.03.187. Hydrożel pNIPA zmodyfikowany grupami –COOH sprawdził się w roli trójwymiarowej matrycy do efektywnego i kontrolowanego unieruchamiania nici DNA. Kluczowym etapem podczas konstrukcji trójwymiarowej matrycy była optymalizacja zawartości procentowej grup karboksylowych, która pozwoliła wybrać hydrożel charakteryzujący się jednocześnie najefektywniejszym wykorzystaniem grup –COOH oraz najlepszymi parametrami mechanicznymi. Najbardziej powtarzalne wyniki uzyskano dla zawartości grup –COOH w przedziale 2  5 %. Unieruchamianie nici DNA w matrycy hydrożelowej następowało na skutek utworzenia wiązania amidowego pomiędzy grupą aminową modyfikującą nić DNA, a grupą karboksylową hydrożelu. Trójwymiarowość matrycy hydrożelowej pozwoliła praktycznie wyeliminować „efekt domina” i wprowadzić o jeden rząd wielkości większą ilość nici DNA, w porównaniu z tradycyjnymi, popularnymi warstwami pośredniczącymi tj. samoorganizujące się monowarstwy tiolowe i warstwy fenylowe. Pomimo stosunkowo wysokiej gęstości DNA w trójwymiarowej matrycy polimerowej wszystkie nici DNA są zdolne do brania udziału w procesie hybrydyzacji, ponieważ każda z unieruchomionych w strukturze żelu nici DNA ma wystarczająco dużo miejsca w porównaniu do tradycyjnych matryc. Zostało to potwierdzone badaniami z wykorzystaniem SEM, EQCM oraz LA ICP MS. Z uwagi na fakt, że unieruchomione nici DNA można łatwo usunąć z matrycy hydrożelowej w środowisku słabo kwaśnym, pozwala to na wielokrotne wykorzystanie danej matrycy. Wyniki dotyczące konstrukcji biosensora DNA z wykorzystaniem matrycy hydrożelowej zostały opublikowane w czasopiśmie Biosensors and Bioelectronics 54 (2014) 222.

The literature reports indicate that biologically important compounds, such as nucleic acid and enzymes, remain electroactive after their deposition on metallic and nonmetallic substrates. This gives us a chance of quantitative control of their surface concentration and of monitoring the changes in their properties. However, the accurate and precise isolation of the signal related to the biomolecule from usually complex background and the formation of good electron transfer between the biomolecule and the electrode surface are still troublesome. The understanding of the mechanism of electron transport through the electrode intermediate layer in the case of biologically active compounds may allow perfecting of the construction of enzymatic electrodes and biosensors in general. This PhD thesis reports on the characteristics of the intermediate layers that make possible the control of quality and orientation (on the surface) of the compounds of big biological importance (DNA and enzymes). Traditionally, this thesis consists of two parts: bibliographical and experimental. The first part consists of seven chapters. They cover the material related to the modification of the electrode surface through the electrodeposition of organic compounds and the self-organisation of thiol layers. The first part gives also the characterization of polymer hydrogels, particularly the pNIPA gel, and lists their applications. In Chapter 5 the composite materials are discussed; the particular attention was given to the composites of the PPy conducting polymer and Au nanoparticles. Next the structure and the functions of DNA and enzymes used in this work are described. Finally the chemicals used and the techniques employed are listed and characterized. I have focused in my doctoral work on the use of diazonium salts, hydrogels and the polymeric composites containing Au nanoparticles. They were used in the modification of electrode surfaces. The surface modification with a uniform phenyl layer can be done by one-electron reduction of a diazonium salt. This electroreduction leads to the formation of a radical which helps to bind the phenyl group with the substrate. Unfortunately, there is a drawback in the use of diazonium salts. The growth of the layer is excessive and cannot be well controlled. A multilayer in the case of biologically important compounds is unwanted. The limitation of the electrolysis time did not give satisfactory results. I have found that to limit the growth of the phenyl layer the appropriate potential should be applied. If the imposed potential is sufficient for the reduction of all diazonium ions at the surface, no growth of the layer above the monolayer will be seen. In addition the obtained layer had the best regularity. This was confirmed by the AFM and PM IRRAS data. The high quality and regularity of the deposited layer resulted always in good activity of the immobilized DNA strands. Only the formation of a phenyl monolayer could lead to highly efficient hybridization process. The results of the electroreduction of diazonium salts and the influence of the quality of the phenyl layer on the DNA behavior are presented in the paper published in Analytical Chemistry 83 (2011) 9281. The synthesis of a diazonium salt takes some time and, in addition, the stability of the salt at room temperature is low. Because of that scientists tried to modify electrode surfaces under in situ conditions. This approach surely saves our time; however, some disadvantages appear. Just because the synthesis is accompanied by some side reactions, the products of the side reactions can also adsorb on the electrode surface. This influences the stability and functionality of the phenyl film. In this thesis it has been shown that under the in situ conditions a very important parameter is the reaction time. It has been proved that similarly as it was seen under the ex situ conditions the appropriate electroreduction potential and molar ratio of the substrates lead to the needed uniformness and thickness of the phenyl layer. The thicker the layer is the more diversified its topography is. The defects in the layer (roughness) apparently worsen its work in the DNA biosensors and the biocells. It has been shown that only a thin, uniform phenyl layer makes possible the successful immobilization of DNA strands capable of effective hybridization and substantially improves the catalytic efficiency of the deposited enzymes. The conditions of the formation of uniform and thin phenyl layer under in situ conditions are presented in the paper published in Electrochimica Acta 126 (2014) 11. Some experiments have been done to compare the functionality of the substrates modified with a layer obtained by the electroreduction of a diazonium salt and a layer formed after selforganization of the thiolated molecules. Both layers fulfilled the functions expected for the intermediate layers in the process of immobilization of biomolecules. However, the quality of the layers strongly depended on the method of their formation. An analysis of the impedance spectra led to a conclusion that the phenyl layers obtained by the electroreduction were much more uniform and stable compared to the layers formed by the selforganization of the thiols; scientific paper in Electroanalysis 24 (2012) 2053. The application of a composite material and a hydrogel led to a substantial development of the surface. This may have some importance in the improvement of sensitivity of the DNA biosensors and the construction of the tests for the presence of of genetically modified food. The detection limit of a DNA biosensor is closely related to the efficiency of the hybridization process and to the number of DNA strands in the sensing layer. The more DNA strands able to participate in the hybridization process the better is the sensitivity of the biosensor. The insertion of Au nanoparticles to the polymer layer deposited on the electrode surface should create especially good conditions for the formation of an effective sensing layer. The modification of the glassy carbon surface with the polypyrrole – Au nanoparticles composite can be done by turning to the electrochemical polymerization. This method combined with pulse deposition and appropriate deposition potential allows obtaining pretty uniform, without defects polymer layers. In the experiments the composites of various layer thickness and constant amount of Au nanoparticles were employed. The impedance data clearly indicated that the charge transfer resistance (Rct) of a model redox couple (ferro/ferricyanides) dropped significantly compared to the value of the undoped polymer. The presence of Au nanoparticles also improved the conductivity of the polymer. Thickness of the polymer layer influenced strongly the structure of Au-nanoparticle layer. The charge transfer resistance value (ferro/ferricyanides) for the thinnest polypyrrole layer (10 nm) was close to that for the bare electrode, which indicates the uniformness of the examined composite layer and uniform distribution of the nanoparticles. An increase in the composite layer thickness resulted in an increase in the Rct value. Thicker layers were also less regular. The funcjonality of the composite: conductive polymer – (Au Nps) In the construction of DNA biosensor are presented in the paper published in Electrochimica Acta http://dx.doi.org/10.1016/j.electacta.2014.03.187. pNIPA hydrogel modified with –COOH groups appeared to be a useful 3D material for effective and controlled immobilization of DNA strands. The key step in the preparation was the optimization of the percentage of the carboxylic groups: the aim was to get the gel with the highest efficiency of the –COOH groups and satisfying mechanical parameters. The best results were obtained for the percentage of the COOH groups in the range 2  5 %. The immobilization of DNA strands was done by the formation of the amide bonds between the amine groups modifying the strands and the carboxylic groups of the gel. The three dimensionality of the hydrogel allowed the elimination of the ‘domino effect’ and the introduction of one-order-of-magnitude bigger number of DNA strands compared to regular sensing layers. Despite really big density of DNA strands in the gel layer all strands could be hybridized. This is because each strand had enough free space around it. This finding was supported by the data obtained in the SEM-, EQCM- and LA ICP MS experiments. The sensor layers can be used repeatedly for various purposes, since the immobilized strands can be easily detached from the gel matrix by slightly acidifying the medium. The results of the influence of hydrożel matrix on DNA biosensor are presented in the paper published in Biosensors and Bioelectronics 54 (2014) 222.