The influence of MutL and MutS DNA repair proteins and environmental conditions on Neisseria gonorrhoeae pathogensis

Neisseria gonorrhoeae (gonokok), sklasyfikowana przez Światową Organizację Zdrowia jako „patogen priorytetowy”, jest obligatoryjnym patogenem człowieka i czynnikiem etiologicznym rzeżączki. Pomimo wzrastającej wiedzy dotyczącej patogenezy N. gonorrhoeae, istotne aspekty interakcji tej bakterii z gospodarzem wciąż pozostają nieznane, co znacząco utrudnia opracowanie skutecznej terapii przeciwko temu patogenowi. Celem niniejszej pracy było poznanie: zmian zachodzących w ludzkich komórkach nabłonkowych na skutek infekcji N. gonorrhoeae oraz wpływu czynników molekularnych (białek MutL i MutS systemu naprawy DNA N. gonorrhoeae) i środowiskowych (obecność komensalnej bakterii Lactobacillus crispatus i jej białek enolazy i syntetazy glutaminowej) na oddziaływanie N. gonorrhoeae z ludzkimi komórkami nabłonkowymi. Przeprowadzona w niniejszej pracy analiza transkryptomu ludzkich komórek nabłonkowych zainfekowanych N. gonorrhoeae, w oparciu o wyniki uzyskane z wykorzystaniem techniki RNA-Seq, wykazała zmiany w ekspresji 304 genów, w komórkach zainfekowanych N. gonorrhoeae w porównaniu do komórek niezainfekowanych. Geny, których ekspresja zmieniła się w ludzkich komórkach nabłonkowych na skutek infekcji N. gonorrhoeae, przypisane zostały do procesów związanych z regulacją ekspresji genów oraz odpowiedzią immunologiczną. Wykazano również zmiany w ekspresji genów kodujących białka zaangażowane w regulację cyklu dobowego i komórkowego oraz organizację macierzy zewnątrzkomórkowej. Białka MutL oraz MutS są białkami systemów naprawy DNA, które mogą być zaangażowane w interakcje bakterii patogennych z komórkami gospodarza. Wcześniejsze analizy zademonstrowały zmiany w ekspresji genów kodujących białka związane z adhezją oraz tworzeniem biofilmów, w mutantach N. gonorrhoeae w genach kodujących białka MutL oraz MutS. W niniejszej pracy wykazano, że mutanty te tworzą biofilmy o zwiększonej biomasie i gęstości, na powierzchniach abiotycznych, w porównaniu do szczepu dzikiego N. gonorrhoeae. Ponadto, mutant N. gonorrhoeae mutS::km, charakteryzował się większą adhezją i inwazyjnością w stosunku do ludzkich komórek nabłonkowych, w porównaniu do szczepu dzikiego. Wykazano również zmiany w ekspresji genów kodujących białka związane z oddziaływaniem z komórkami gospodarza, w N. gonorrhoeae mutS::km, podczas infekcji ludzkich komórek nabłonkowych, w porównaniu do szczepu dzikiego N. gonorrhoeae. Zademonstrowano także wzrost ekspresji genów kodujących receptory wykorzystywane przez N. gonorrhoeae, w ludzkich komórkach nabłonkowych zainfekowanych N. gonorrhoeae mutS::km, w porównaniu do ekspresji tych genów w ludzkich komórkach nabłonkowych zainfekowanych szczepem dzikim. Obecność bakterii naturalnego mikrobiomu pochwy, chroniących tę niszę ekologiczną przed kolonizacją bakterii patogennych, stanowi jeden z czynników środowiskowych wpływających na patogenezę N. gonorrhoeae. W niniejszej pracy wykazano, że L. crispatus, będący jednym z dominujących gatunków naturalnego mikrobiomu żeńskich dróg rodnych oraz oczyszczone białka: enolaza oraz syntetaza glutaminowa L. crispatus, ograniczają adhezję i inwazyjność N. gonorrhoeae względem ludzkich komórek nabłonkowych. Ponadto, prekolonizacja ludzkich komórek nabłonkowych L. crispatus lub ich preinkubacja z enolazą lub syntetazą glutaminową, poprzedzająca infekcjęN. gonorrhoeae, skutkuje obniżeniem ekspresji genów CCL20 oraz TNF-α kodujących cytokiny prozapalne, w porównaniu do ekspresji analizowanych genów w komórkach zainfekowanych wyłącznie N. gonorrhoeae. Otrzymane w niniejszej pracy wyniki wskazują, że patogeneza N. gonorrhoeae, jest złożonym procesem, a na bezpośrednie oddziaływanie pomiędzy gonokokami i gospodarzem, wpływają m. in. czynniki molekularne i środowiskowe, takie jak fenotyp mutatorowy bakterii patogennej, a także obecność innych bakterii zasiedlających tę samą niszę ekologiczną.

Neisseria gonorrhoeae (gonococcus), classified by the World Health Organization as a “priority pathogen”, is an obligatory human pathogen and an etiological agent of sexually transmitted disease – gonorrhea. Despite the growing knowledge about pathogenesis of N. gonorrhoeae, there are still many aspects of interactions of this bacterium with its host, that require investigation to effectively eradicate this microorganism. The aim of this work was to evaluate: changes in N. gonorrhoeae-infected epithelial cells, and the impact of molecular (N. gonorrhoeae DNA repair proteins MutL and MutS) and environmental (presence of commensal bacterium Lactobacillus crispatus and its proteins enolase and glutamine synthetase) factors on interactions of N. gonorrhoeae with human epithelial cells. Performed transcriptome profiling of human epithelial cells infected with N. gonorrhoeae, using RNA-Seq technique, revealed a total of 304 genes that were differentially expressed in infected cells compared to uninfected cells. Gene Ontology and pathway enrichment analyses revealed that the most enriched pathways were Gene expression (Transcription) and Immune System. Further, the differentially expressed genes also encoded proteins related to the circadian clock, extracellular matrix organization, and cell cycle regulation. Results obtained in this work demonstrated, that both N. gonorrhoeae proteins (MutL and MutS) and environmental factors influence the pathogenesis of N. gonorrhoeae. MutL and MutS proteins, are known proteins involved in DNA repair systems, however, these proteins can also be involved in the interactions of pathogenic bacteria with host’s epithelial cells. It was previously demonstrated, that in N. gonorrhoeae mutL and mutS mutants, a subset of differentially expressed genes encoded proteins that can influence adhesion and biofilm formation. Results obtained in this work demonstrated that N. gonorrhoeae mutL and mutS mutants formed denser biofilms with increased biofilm-associated biomass on the abiotic surfaces compared to the wild-type strain. N. gonorrhoeae mutS::km was also more adherent and invasive toward epithelial cells than the wild-type N. gonorrhoeae. Additionally, during infection of epithelial cells with N. gonorrhoeae mutS::km, the expression of some bacterial genes encoding proteins that can influence gonococcal adhesion was changed compared with their expression in the wild-type N. gonorrhoeae. Furthermore, during infection of epithelial cells with N. gonorrhoeae mutS mutant, expression of human genes encoding receptors utilized by N. gonorrhoeae was changed, in comparison to their expression in human epithelial cells infected with the wild-type strain. During infection, N. gonorrhoeae is exposed to many environmental factors, including presence of natural vaginal microbiome, that protect infected niche against colonization of pathogenic bacteria. In this work, it was demonstrated, that L. crispatus, which is one of the most prevalent bacteria in genitourinary tract in women, and its enolase and glutamine synthetase, impaired the adhesion and invasiveness of N. gonorrhoeae toward human epithelial cells. Moreover, precolonization of epithelial cells with L. crispatus or preincubation with L. crispatus purified enolase or glutamine synthetase prior to infection with N. gonorrhoeae, decreased the expression of proinflammatory cytokine-encoding genes: CCL20 and TNF-α, compared to their expression in untreated epithelial cells but infected with N. gonorrhoeae. Obtained results, indicate that the pathogenesis of N. gonorrhoeae is a complex process, in which beside direct interaction between host and gonococci, molecular and environmental factors play also a crucial functions, including mutator phenotype of pathogenic bacteria, and presence of other bacteria, that inhabit the same ecological niche.