Identification and characterization of Alphaproteobacteria phages

Celem pracy doktorskiej było (i) poznanie różnorodności (pro)fagów infekujących bakterie z rodzajów Sinorhizobium, Paracoccus oraz Ochrobactrum, (ii) określenie podobieństwa i pokrewieństwa pomiędzy (pro)fagami Alphaproteobacteria oraz (iii) identyfikacja tzw. dodatkowej informacji genetycznej w genomach analizowanych (pro)fagów i określenie jej wpływu na funkcjonowanie gospodarzy. W ramach przeprowadzonych badań zidentyfikowano i scharakteryzowano 360 bakteriofagów infekujących bakterie z rodzajów Sinorhizobium (23 profagi), Paracoccus (5 fagów lizogennych oraz 53 profagi), a także Ochrobactrum (2 fagi wirulentne oraz 277 profagi). Aktywne fagi zostały dokładnie scharakteryzowane, określono ich przynależność taksonomiczną, poznano sekwencje genomów oraz aktywność wybranych modułów genetycznych. Wszystkie analizowane fagi poddano również wnikliwym analizom z zakresu genomiki porównawczej i określono ich podobieństwo do znanych bakteriofagów. Pierwsze badania przeprowadzono analizując genom niesymbiotycznego i metalotolerancyjnego szczepu Sinorhizobium sp. LM21, w którym zidentyfikowano cztery regiony profagowe. Jeden z nich to zaindukowany wcześniej fag ΦLM21. Spośród trzech pozostałych, dwa uznano za kompletne profagi. W obrębie modułów replikacyjnych tych profagów, podobnie jak w przypadku faga ΦLM21, zidentyfikowano metylotransferazy DNA o specyficzności metylotransferazy CcrM, regulującej cykl komórkowy Alphaproteobacteria. Metylotransferazy te nie wykazywały jednak podobieństwa na poziomie sekwencji aminokwasowej do metylazy CcrM gospodarza. Tym samym wykazano występowanie zjawiska mimikry molekularnej. Identyfikacja 20 kompletnych genomów profagów w genomach Sinorhizobium spp. pozwoliła na analizę rozpowszechnienia tego zjawiska. W obrębie analizowanych genomów fagowych zidentyfikowano 26 genów kodujących metylotransferazy DNA. Wśród nich zidentyfikowano również grupę enzymów z motywem katalitycznym NPP(Y/F/W) o tej samej specyficzności co metylaza CcrM. Ponadto, porównanie genomów (pro)fagów Sinorhizobium spp. w oparciu o białkowe sieci podobieństwa pozwoliło na wykazanie dużej różnorodności badanych fagów. W toku dalszych badań zidentyfikowano i scharakteryzowano fagi bakterii z rodzaju Paracoccus. Udało się zaindukować 5 fagów lizogennych: vB_PbeS_Pben1, vB_PkoS_Pkon1, vB_PsuS_Psul1, vB_PthS_Pthi1 i vB_PyeM_Pyei1. Ich genomy zostały następnie zsekwencjonowane i poddane dalszym analizom. Spośród zaindukowanych fagów vB_PyeM_Pyei1 był pierwszych opisanym fagiem Myoviridae, infekującym bakterie z rodzaju Paracoccus. W genomach fagów vB_PbeS_Pben1 oraz vB_PkoS_Pkon1 zidentyfikowano systemy toksyna-antytoksyna, odpowiednio typu hicAB oraz relBE, które zbadano w układzie heterologicznym, wykazując aktywność pierwszego z nich. Ponadto, w 63 genomach Paracoccus spp. zidentyfikowano 53 nowe kompletne profagi, które następnie zadnotowano, sklasyfikowano i poddano analizom porównawczym. Wśród nich wyróżniono kolejnego przedstawiciela rodziny Myoviridae oraz pierwsze podowirusy infekujące Paracoccus spp. Pokazano również, że prawie połowa szczepów niosących profagi jest polilizogenami. W drodze analizy występowania dodatkowych modułów genetycznych w genomach badanych (pro)fagów, wykazano obecność 88 metylotransferaz DNA w genomach 48 profagów, które sklasyfikowano jako metylotransferazy m6A/m4A (58) oraz metylazy m5C (30). Ponadto, większość z nich (59), w tym wszystkie 39 metylotransferaz m6A/m4A z dodatkową domeną ParB, była zlokalizowana w locus ParB-Tl. Poprzez sieciowanie proteomów 66 (pro)fagów Paracoccus spp. pokazano ich unikatowość w stosunku do znanych bakteriofagów. W ostatnim etapie badań przeprowadzono analizę fagów bakterii z rodzaju Ochrobactrum. W próbkach surowych osadów ściekowych zidentyfikowano dwa fagi wirulentne, vB_OspM_OC i vB_OspP_OH, zdolne do infekcji szczepu Ochrobactrum sp. POC9, wykorzystywanego do zwiększenia efektywności produkcji biogazu w oczyszczalniach ścieków. W ten sposób zidentyfikowano pierwsze wirulentne fagi Ochrobactrum, które zostały sklasyfikowane do rodzin Myoviridae (vB_OspM_OC) oraz Podoviridae (vB_OspP_OH). Ponadto, vB_OspP_OC, został zaliczony do grupy tzw. gigantycznych („jumbo”) fagów. W genomie tego faga zidentyfikowano również gen kodujący metylotransferazę DNA o specyficzności metylazy CcrM, która wykazywała podobieństwo na poziomie aminokwasowym do metylotransferazy CcrM szczepu POC9. W celu określenia pokrewieństwa zidentyfikowanych fagów, porównano je z 277 profagami wyróżnionymi w genomach Ochrobactrum spp. i innymi znanymi bakteriofagami, pokazując ich różnorodność i unikatowość. W ramach analiz funkcjonalnych fagów, sprawdzono również zakres gospodarzy fagów vB_OspM_OC i vB_OspP_OH, a także zbadano efektywność ich adsorpcji do komórki gospodarza i jej lizy, ich cykl życiowy oraz stabilność w różnych warunkach.

The aim of this Ph.D. thesis was to (i) explore the diversity of (pro)phages infecting bacteria of Sinorhizobium, Paracoccus and Ochrobactrum genera, (ii) determine the similarity and relationship amongst Alphaproteobacteria (pro)phages and (iii) identify auxiliary genetic load within analyzed (pro)phage genomes to indicate its potential influence on the host phenotype. In this work, 360 novel (pro)phages infecting Sinorhizobium spp. (23 prophages), Paracoccus spp. (5 temperate phages and 53 prophages) and Ochrobactrum spp. (2 virulent phages and 277 prophages) were identified. Active phages were characterized and classified, their genomes were sequenced, and the activity of selected genetic modules was experimentally verified. All analyzed phages were subjected insightful comparative genomics analyses and their similarity to known phages was described. Firstly, the genome of nonsymbiotic metallotolerant strain Sinorhizobium sp. LM21 was analyzed and four prophage regions were indicated. One of those belonged to previously induced phage ΦLM21, while among the other three, two were considered as complete prophages. Within replication modules of those prophages, similarly to ΦLM21, DNA methyltrasferases with CcrM specificity, regulating the cell cycle in Alphaproteobacteria, were identified. This showed the presence of molecular mimicry. Moreover, the identification of 20 prophages within the genomes of complete Sinorhizobium spp. allowed analyzing the commonness of described phenomenon. Within their genomes 26 DNA methyltransferases were identified, among which a group of enzymes with NPP(Y/F/W) catalytic motif and CcrM specificity was identified. Moreover, the comparison of Sinorhizobium (pro)phages, based on protein-based similarity network, showed high diversity of phages infecting Sinorhizobium spp. Further research considered identification and characterization of Paracoccus spp. phages. Prophage induction survey of 15 Paracoccus strains resulted in induction of 5 temperate phages: vB_PbeS_Pben1, vB_PkoS_Pkon1, vB_PsuS_Psul1, vB_PthS_Pthi1 and vB_PyeM_Pyei1, which genomes were afterwards sequenced. Among induced phages, vB_PyeM_Pyei1 was the first described Myoviridae phage. Within the genomes of vB_PbeS_Pben1 and vB_PkoS_Pkon1 toxin-antitoxin systems, accordingly hicAB and relBE, were identified and subsequently experimentally verified. This showed that only the first one was active in heterological host. Moreover, in 63 Paracoccus spp. genomes 53 novel complete prophages were identified. Those were reannotated, classified and subjected to comparative analyses. Among those, another representative of Myoviridae family was identified, as well as the first podoviruses infecting Paracoccus spp. It was shown that nearly half of analyzed genomes carrying prophages were polilysogens. The analysis of their additional genetic load revealed the presence of 88 DNA methyltranferases within the genomes of 48 prophages. Those were classified as m6A/m4A (58) and m5C (30) DNA methyltransferases. Furthermore, the majority of them (59), including all 39 m6A/m4A methyltransferases with additional ParB domain, was localized in ParB-Tl locus. Additionally, the uniqueness of 66 Paracoccus spp. (pro)phages in comparison with known phages was shown through the construction of protein-based similarity network. Lastly, phages infecting Ochrobactrum spp. were analyzed. Within raw sewage samples two virulent phages, vB_OspM_OC and vB_OspP_OH classified to Myoviridae and Podoviridae families, respectively, were identified. These were the first identified virulent phages infecting Ochrobactrum spp.. Additionally, vB_OspM_OC was classified as a giant, so called “jumbo”, phage. Also, within its genome DNA methyltransferase with CcrM specificity and sequence homology to host-encoded CcrM methyltransferase was identified. The relationships of both identified phages was based on the comparison of those to 277 distinguished prophages in Ochrobactrum spp. genomes, as well as other known phages. This showed how diverse and distinct they are. Phages vB_OspM_OC and vB_OspP_OH were also subjected to functional analyses which included testing of the host range, life cycle, effectiveness of host cell adsorption and bacterial cell lysis, as well as their stability under various physical and chemical conditions.