A computational model of molecular mechanism behind the half-the-sites activity of thymidylate synthase

Białka są przedmiotem zainteresowania wielu prac eksperymentalnych i teoretycznych z uwagi na różne aspekty ich budowy i funkcji, np.: przewidywanie struktury trzeciorzędowej białek, rozpoznawanie substratu przez białko, allosteryczność, zwijanie/rozwijanie białek, wiązanie przez nie RNA czy badanie ich zmian konformacyjnych. Badania zespołu prof. Wojciecha Rode z Instytutu Biologii Doświadczalnej PAN dotyczące różnych aspektów biosyntezy tymidylanu, a w szczególności enzymologii, regulacji oraz inhibicji tego procesu, jak również modyfikacji potranslacyjnych oraz ich wpływu na właściwości enzymów, ze szczególnym zainteresowaniem skierowanym na syntazę tymidylanową -- poszukiwanie nowych leków skierowanych przeciwko niej, selektywność i mechanizm działania, mechanizmy inhibicji tego enzymu oraz jej specyficzności -- stały się inspiracją do podjęcia badań teoretycznych. Tematyka obecnej rozprawy została zainicjowana licznymi dyskusjami na temat podstaw molekularnych funkcjonowania tego enzymu. Syntaza tymidylanowa (TS) jest dimerycznym enzymem katalizującym metylowanie deoksyurydyno-5'-monofosforanu (dUMP) przy pomocy 5,10-metyleno-5,6,7,8-tetrahydrofolianu (CH_2THF) jako kofaktora do deoksytymidyno-5'-monofosforanu (dTMP) i dihydrofolianu (DHF). W ten sposób syntaza tymidylanowa odgrywa ogromną rolę w replikacji DNA, dostarczając prekursor jednego z nukleotydów -- deoksytymidyno-5'-trifosforanu (dTTP). Z uwagi na to, że jest jedynym źródłem dTMP w komórce, stanowi cel w chemioterapii przeciwnowotworowej, przeciwwirusowj, przeciwgrzybiczej i przeciwpierwotniaczej. Budowa oraz mechanizm reakcji katalizowanej przez TS wraz z innymi aspektami jej funkcjonowania zostały przedstawione w rozdziale 2. dysertacji. Kilkanaście lat temu postawiono hipotezę, że syntaza tymidylanowa jest enzymem o aktywności typu half-the-sites, tzn. że jej oba miejsca aktywne (każde na jednej z podjednostek dimeru) nie są równocenne i nie działają jednocześnie w tym samym czasie. Takie założenie implikuje wzajemne komunikowanie się obu podjednostek w czasie przyłączania substratu i kofaktora podczas przebiegu katalizowanej reakcji. Prezentowana praca jest próbą rozwiązania tego problemu przy pomocy dwóch różnych metod. W pierwszym podejściu badano niskoczęstościowe drgania normalne syntazy tymidylanowej pozbawionej ligandu. Takie drgania odpowiadają zbiorowym ruchom większych fragmentów białka i mają duże znaczenie biologiczne, np. odpowiadając za otwieranie się i zamykanie dostepu do miejsca aktywnego. Im mniej zlokalizowany jest to ruch, tym większe fragmenty białka są zaangażowane w jego wykonanie. Drgania normalne o niskich częstotliwościach zostały obliczone przy pomocy programu Elastic Network Model i nakładki internetowej do niego -- ElNemo. Uzyskano w ten sposób wiele symetrycznych i asymetrycznych drgań. Ich analiza pokazała różnice w zachowaniu się obu miejsc aktywnych enzymu, wskazując, że pomimo identycznej budowy nie są równocenne. Dla wybranych siedmiu symetrycznych i dziewięciu asymetrycznych drgań normalnych obliczono wartości powierzchni dostępnej dla rozpuszczalnika w miejscu aktywnym, SASA (ang. solvent-accessible surface area). Wartości te były przeważnie większe dla jednej podjednostki i równolegle towarzyszyły im zmiany wartości odległości między wybranymi aminokwasami. Analiza drgań pokazała, że najbardziej ruchliwymi częściami syntazy tymidylanowej są pętle wyściełające wejście do miejsca aktywnego, jak również jedna z helis (helisa K) -- uczestniczą niemal w każdym drganiu normalnym i mają swój udział w zamykaniu się miejsca aktywnego po tym, jak zwiąże się ono z ligandem. Jedna z tych pętli zawiera specyficzną wstawkę występującą tylko u ssaków i może wykonywać zarówno ruch ścinający (ang. shear motion), jak i ruch zawiasowy (ang. hinge motion). Druga z tych pętli stanowi fragment N-końca i służy jako wieczko przy zamykaniu się miejsca aktywnego. Jednocześnie zawiera aminokwasy, które jako pierwsze ,,wyczuwają'' obecność substratu oraz biorą udział w komunikowaniu się obu podjednostek enzymu. Śledząc różnice w upakowaniu aminokwasów w badanym enzymie na krawędziach \beta-kartek budujących interfejs, czyli miejscu styku dwóch podjednostek, oraz opierając się o dane literaturowe, nasze badania potwierdzają, że przekazywanie zmian strukturalnych między jednym miejscem aktywnym a drugim może się odbywać przez interfejs. Ponadto w czasie wykonywania drgań normalnych, zwłaszcza asymetrycznych, syntaza tymidylanowa ułatwia dostęp do jednego centrum aktywnego, jednocześnie utrudniając dojście do drugiego. Jest to ważna cecha dynamiczna enzymu, która -- wraz z jego budową -- prawdopodobnie odpowiada za jego aktywność typu half-the-site. Nierównocenność w działaniu obu podjednostek dimeru oraz jego centrów aktywnych została również rozpoznana w badaniach z zastosowaniem dynamiki molekularnej prowadzonych w środowisku denaturującym -- w 8-molowym roztworze mocznika lub 6-molowym roztworze chlorowodorku guanidyny (GuHCl). Badania były przeprowadzone dla dwóch wersji dimeru TS (AB i CD) o różnych gęstościach elektronowych. Mimo tak drastycznych warunków znaczna część struktury syntazy tymidylanowej pozostała uporządkowana. Jednocześnie trzy wspomniane wyżej fragmenty enzymu mające swój udział w zamykaniu się miejsca aktywnego (dwie pętle i helisa) okazały się najbardziej ruchliwymi częściami białka. W czasie symulacji w roztworze mocznika rozwijały się i wyginały w różnych kierunkach, przy czym ten ruch zachodził inaczej w obu podjednostkach. Przemieszczenia podanych fragmentów były zawsze większe w monomerze A lub C i prowadziły do częściowego zniszczenia struktury trzeciorzędowej tych miejsc, jednak zmiany w strukturze drugorzędowej (rozwijanie się helis i degradacja beta-kartek) były większe w monomerach B i D. Przeprowadzone symulacje pozwoliły również na zaobserwowanie początkowej fazy rozwijania się syntazy tymidylanowej. Zastosowane warunki (8 M roztwór mocznika lub 6 M roztwór chlorowodorku guanidyny i temperatura 310 K) pozwoliły wprawdzie dostrzec skromne zmiany zachodzące w enzymie, jednak ukazują one wyłącznie wpływ czynników denaturujących na strukturę białka bez udziału wysokiej temperatury. Rozwijaniu się białka, które zachodziło inaczej w obu podjednostkach, towarzyszył wzrost wartości RMSD oraz SASA. Zmiany były zawsze większe w jednej z nich i były nieporównywalne w obu. Konsekwencją były zmiany w układzie aminokwasów zaangażowanych w tworzenie miejsc aktywnych -- niektóre z nich znajdowały się daleko od ich pierwotnej lokalizacji. Tak zachodzące zmiany w pierwszym etapie denaturacji syntazy tymidylanowej są argumentem wspierającym hipotezę, że TS jest enzymem o aktywności typu half-the-site. Bogate dane literaturowe dotyczące tematu rozwijania białek ujawniają, że denaturacja białek przebiega znacznie łatwiej w GuHCl niż w moczniku, nawet jeśli stosuje się mniejsze stężenia GuHCl niż mocznika. Nasze wyniki pokazują jednak coś przeciwnego. Chlorowodorek guanidyny powodował jedynie małą zmianę w strukturze białka, podczas gdy mocznik spowodował, że białko straciło lokalnie swoją trzeciorzędową strukturę, wskazując w ten sposób, że mocznik jest silniejszym czynnikiem denaturującym niż GuHCl, przynajmniej w zastosowanych stężeniach i warunkach symulacji. Jednakże objaśnienie podstaw molekularnych eksperymentalnie stwierdzonej łatwiejszej denaturacji białek przez GuHCl niż przez mocznik wymaga dalszych badań symulacyjnych, w tym m.in. zastosowanie szerszego spektrum stężeń czynników denaturujących, wydłużonych czasów symulacji czy też zbadanie efektu temperaturowego. Rozprawa doktorska została napisana w języku angielskim.

Proteins have been the subject of many experimental and theoretical studies that covered various aspects of their structure and function, e.g., structure prediction (basing on amino acid sequence), substrate recognition, allostery, protein folding/unfolding, RNA binding, conformational changes in proteins. The studies conducted by Wojciech Rode and his group from Nencki Institute of Experimental Biology Polish Academy of Sciences regarding various aspects of biosynthesis of thymidylate, such as its enzymology, regulation and inhibition, with particular interest in thymidylate synthase -- searching for new inhibitors/drugs, drug resistance, specificity and mechanism of action, as well as mechanisms of enzyme inhibition and its specificity -- became an inspiration to undertake theoretical studies in this field. The subject of the presented dissertation has been inspired by numerous discussions on the molecular basis of functioning of this enzyme. Thymidylate synthase (TS) is an alluring and significant protein. It is an enzyme catalyzing reductive methylation of deoxyuridine monophosphate (dUMP) using 5,10-methylene-5,6,7,8-tetrahydrofolate as a cofactor, and yielding deoxythymidine monophosphate (dTMP) and dihydrofolate (DHF). Thus, it plays an enormous role in DNA replication providing a precursor of one of the nucleotides (dTTP). And since it is the sole source of dTMP in a cell, it is an important target enzyme in anticancer chemotherapy, as well as in antiviral, antiprotozoal, and antifungal therapies. Its structure, catalytic role, and other aspects of its function are presented in chapter 2. Lately, there has been posed a plausible hypothesis that thymidylate synthase is a half-the-sites activity enzyme, what implies a “communication” of its both subunits while binding a substrate and a cofactor in the catalytic reaction. It is a fascinating, yet not extensively investigated problem. This study is an attempt to address this phenomenon from two different perspectives. In the first approach the low-frequency normal modes of ligandless thymidylate synthase were investigated. These low-frequency modes relate to collective motions of segments in a protein and are of great biological importance, e.g., they contribute to opening and closing of the active sites. This involves a complex motion of many different parts of the enzyme: the less localized the normal mode, the more portions of the protein it entails. With the use of the web interface to the Elastic Network Model, ElNemo, we have identified several symmetric and asymmetric normal modes. Their analysis demonstrated the differences in the behaviour of each of the two active sites, as well as a nonequivalence of the two subunits of TS dimer, suggesting a possible pathway of communication between them. Seven symmetric and nine asymmetric normal modes display SASA (solvent-accessible surface area) changes in both active sites of the dimer. SASA values are usually greater in one subunit and are accompanied by synchronized changes in the values of chosen distance monitors. The asymmetric modes are the most common amongst the 25 lowest-frequency normal modes for the enzyme. While performing them, the protein facilitates the access to one active site, hindering simultaneously the access to the other one. The most engaged sections of TS are the loops lining the entrance to the active site, as well as helix K -- they have their part in almost every normal mode and happen to be the three segments that contribute to active site closure upon ligands binding. One of these loops includes mammalian specific insertion, containing S114, and can perform both hinge and shear motion. The other loop is the N-terminal one which serves as a lid to the active site pocket and provides with amino acids that sense the presence of a substrate on one hand and take part in the intersubunit communication on the other hand. Based on the literature data that regards relaying structural changes from one active site to the other through the interface and connected with it negative cooperativity in ligand binding, our studies trace and confirm the differences in the proposed packing interactions at the edges of the beta-sheet as a possible pathway communicating the two active sites. Along with another observation that while executing normal modes, especially the asymmetric ones, thymidylate synthase hampers the access to one active center and makes it easy to the other, which represents an important dynamic feature of the enzyme, these probably account for the half-the-sites activity. This nonequivalence in the behaviour of the two subunits and their active sites of the studied protein was also recognized in molecular dynamics simulation studies in denaturing environment of 8-molar urea or 6-molar guanidinium chloride. These studies were conducted for two versions of thymidylate synthase dimer (AB and CD) with different electron densities. In such conditions, thymidylate synthase kept a substantial portion of ordered structure, the fact that is acknowledged by the literature data on research of proteins submitted to strongly denaturing conditions. But at the same time, the three segments of TS that contribute to active site closure upon ligands binding to it -- two loops and helix K, turned out to be the most mobile part of the enzyme. While in urea, they were frolicking during the whole simulation time, however this occurred differently in both subunits (no matter if AB or CD dimer was take into account). The displacement was always greater in A or C monomer as to partially destruct the tertiary structure, however greater changes in the secondary structure were found in B or D subunit. Also, the very beginning of unfolding of thymidylate synthase dimer was observed. The chosen conditions (8 M urea or 6 M guanidinium chloride and temperature of 310 K) allowed for detecting only early changes in the protein structure, but are the first that model the influence of solely the denaturant, and not the temperature, on protein. The observed unfolding was proved by increasing RMSD and solvent-accesible surface area values, and proceeded unequally with respect to dimer subunits. The changes were always greater in one subunit and occurred unevenly. This was followed by the changes in the arrangement of amino acids involved in active site formation, as some of them were found far from their original location. This is an argument in favor of the hypothesis that TS is a half-the-sites activity enzyme. Abundant literature data on the topic of unfolding of proteins reveals that denaturation of proteins proceeds much more easily in GuHCl than in urea, even when smaller concentrations of the former are used. However, our results demonstrate something opposite. Guanidinium chloride brought about only small response in the protein structure, while urea caused the protein to lose locally its tertiary structure, thus pointing out that urea is more potent denaturant than GuHCl, at least in the applied concentrations (8 M for urea and 6 M for GuHCl). However, the elucidation of the molecular basis of the experimentally established easier denaturation of proteins in GuHCl than in urea requires further MD simulations, including the use of wider spectrum of concentration of denaturing agents, prolonged simulation times, or investigating the temperature effect.