Wykorzystanie metod biofizycznych w poszukiwaniu i badaniu selektywnych inhibitorów białek odpowiedzialnych za degradację struktury końca 5’ mRNA

Na końcu 5’ każdej cząsteczki eukariotycznego mRNA znajduje się charakterystyczna struktura 7-metyloguanozyny, zwana też czapeczką lub kapem. Pełni ona w organizmie szereg bardzo istotnych funkcji – do najważniejszych należy ochrona informacyjnego RNA przed przedwczesną degradacją przez nukleazy i udział w inicjacji procesu translacji. mRNA jest jednak z istoty cząsteczką nietrwałą i po spełnieniu swojego zadania ulega degradacji. Odbywa się ona na dwóch alternatywnych ścieżkach – albo w kierunku od końca 5’ do końca 3’, albo w kierunku odwrotnym. Pierwsza z nich jest inicjowana przez proces zwany dekapingiem, który polega na usunięciu struktury kapu i dalszej degradacji transkryptu przez odpowiednie egzonukleazy. Tempo hydrolizy 7-metyloguanozyny ma więc bezpośredni wpływ na kontrolę stabilności mRNA, a tym samym odgrywa kluczową rolę w ekspresji genów. Enzymy, które są zaangażowane w ten mechanizm, są często celami terapeutycznymi w leczeniu różnych typów chorób, a poszukiwanie ich inhibitorów może mieć korzystne znaczenie z punktu widzenia projektowania leków celujących w te enzymy. Głównym celem projektu doktorskiego było opracowanie nowej metody, która umożliwiła monitorowanie aktywności enzymów odpowiedzialnych za degradację końca 5’ mRNA i zaadaptowanie jej do formatu wysokoprzepustowego. Pozwoliło to w sposób szybki i efektywny przeszukiwać biblioteki związków w celu identyfikacji nowych, selektywnych inhibitorów dwóch enzymów dekapujących - wirusowego enzymu D9 z wirusa ospy krowiej oraz ludzkiego enzymu DCP2, który wchodzi w skład większego kompleksu dekapującego PNRC2-DCP1-DCP2. W pracy przedstawiono proces opracowywania metody opartej o pomiar intensywności fluorescencji (FLINT) do śledzenia aktywności enzymów w czasie rzeczywistym, a także zaadaptowania jej do formatu wysokoprzepustowego wraz z optymalizacją warunków metody oraz jej walidacją. W następnym kroku wykorzystano opracowaną metodę do badań przesiewowych bibliotek małocząsteczkowych związków – niewielkiej biblioteki związków pochodzenia nukleotydowego oraz komercyjnej biblioteki związków farmakologicznie czynnych LOPAC®1280 . Wyłonione w eksperymentach przesiewowych hity poddano dalszej ocenie, w tym określeniu ich wartości parametru IC50. Wyniki te zostały następnie potwierdzone niezależną metodą przez monitorowanie reakcji dekapingu na krótkim substracie RNA in vitro. Sprawdzono również selektywność zidentyfikowanych związków względem innych enzymów dekapujących. Na końcu zostały opisane badania strukturalne, które pozwoliły na scharakteryzowanie oddziaływania jednego z enzymów ze zidentyfikowanym metodą FLINT inhibitorem na poziomie atomowym. Otrzymane wyniki dostarczyły wielu cennych informacji na temat preferencji strukturalnych obu enzymów względem potencjalnych inhibitorów oraz pozwoliły wyselekcjonować kilka związków wykazujących silne właściwości hamujące aktywność badanych enzymów i posłużą lepszemu projektowaniu nowych związków o pożądanych właściwościach inhibitorowych i potencjalnym znaczeniu terapeutycznym.

In eukaryotes mRNA is modified by the addition of 7-methylguanosine, also known as the cap. This unique structure serves several critical functions in the organism, with the most important being the protection of messenger RNA from premature degradation by nucleases and participation in the translation initiation. However, mRNA is inherently unstable and, after fulfilling its role, undergoes degradation. This degradation may occur through two alternative pathways – either from the 5' to the 3' end or in the reverse direction. The first of these is initiated by a process called decapping, which involves the removal of the cap structure and further degradation of the transcript by specific exonucleases. The rate of cap hydrolysis directly affects the control of mRNA stability and thus plays a key role in gene expression. Enzymes involved in this mechanism are often therapeutic targets in the treatment of various diseases, and the search for their inhibitors can be beneficial from the perspective of drug design aimed at targeting these enzymes. The main objective of the doctoral project was to develop a new method that could be used to monitor the activity of enzymes responsible for the degradation of the 5' end of mRNA and adapt it to a high-throughput format. This enabled rapid and efficient screening of compound libraries to identify new, selective inhibitors of two decapping enzymes – the viral D9 enzyme from the Vaccinia virus and the human DCP2 enzyme, which is part of the larger decapping complex PNRC2-DCP1-DCP2. The dissertation presents the development of the method based on fluorescence intensity measurement (FLINT) to track enzyme activity in real-time, as well as its adaptation to a high-throughput format, including method optimization and its validation. In the next step, the developed method was used for screening small-molecule compound libraries – a small nucleotide-derived compound library and the commercially available LOPAC®1280 library of pharmacologically active compounds. The hits identified in the screening experiments were further evaluated, including the determination of their IC50 values. These results were then confirmed by an independent method through monitoring the decapping reaction on a short RNA substrate in vitro. The selectivity of the identified compounds against other decapping enzymes was also tested. Finally, structural studies were described, allowing the characterization of the interaction between one of the enzymes and the FLINT-identified inhibitor at the atomic level. The obtained results provided valuable insights into the structural preferences of both enzymes towards potential inhibitors and allowed the selection of several compounds that exhibited strong inhibitory properties against the studied enzymes. These findings will contribute to the better design of new compounds with desirable inhibitory properties and potential therapeutic significance.