miRNA w regulacji różnicowania miogenicznego mysich zarodkowych komórek macierzystych

miRNA są istotnymi regulatorami różnicowania podczas rozwoju zarodkowego. Jednak, funkcje tych cząsteczek w powstawaniu wielu rodzajów komórek, w tym mioblastów mięśni szkieletowych nie są w pełni zbadane. W pracy wykorzystano mysie zarodkowe komórki macierzyste (komórki ES), które są pluripotencjalne i mogą różnicować we wszystkie komórki budujące organizm. Analizowano dwie linie mysich komórek ES metodami pozwalającymi określić ekspresję genów związanych z pluripotencją oraz różnicowaniem miogenicznym. Komórki różnicowały in vitro w pożywce zawierającej m.in. kwas retinowy, co umożliwiło uzyskanie mioblastów mięśni szkieletowych. Globalna analiza miRNA w niezróżnicowanych jak i różnicujących komórkach ujawniła znaczące różnice w profilu ekspresji tych cząsteczek. Przeprowadzone badania wykazały istotne różnice w ekspresji m.in. takich cząsteczek jak miR145 oraz miR181, które regulują różnicowanie komórek ES oraz wielu innych rodzajów komórek, w tym mioblastów mięśni szkieletowych. Wykazano także różnice w ekspresji miR206, cząsteczki specyficznej dla mioblastów mięśni szkieletowych. W drugiej części pracy, sprawdzono, w jaki sposób badane miRNA przyczyniają się do różnicowania komórek ES. W tym celu wykorzystano przejściową nadekspresję tych cząsteczek. Do niezróżnicowanych komórek ES wprowadzono niezależnie cząsteczki takie jak miR145, miR181 oraz miRNA z rodziny miR1, do których należą miR1, miR133a, miR133b oraz miR206. Komórki następnie różnicowano in vitro, po czym badano ekspresję genów oraz białek regulujących różnicowanie komórek ES oraz różnicowanie miogeniczne. Badania te wykazały, że przejściowa nadekspresja niektórych miRNA może indukować różnicowanie miogeniczne komórek ES. Pod wpływem przejściowej nadekspresji uzyskano m.in. wzrost poziomu takich transkryptów jak Pax3, Pax7, Myf5, Myog, Myod1, Myh2. W części trzeciej, przeprowadzono także analizę profilu miRNA w liniach komórek ES pozbawionych funkcjonalnego genu Pax7, kodującego czynnik transkrypcyjny, który reguluje różnicowanie miogeniczne. Komórki te różnicowano in vitro oraz in vivo. Następnie przeprowadzono analizę ekspresji miRNA związanych z pluripotencją oraz różnicowaniem miogenicznym. Analizy te wykazały, że Pax7 pełni istotną rolę w regulacji ekspresji miogenicznych miRNA. W komórkach ES różnicujących in vitro, a więc takich, które odzwierciedlają wcześniejsze etapy różnicowania miogenicznego, obserwowano niższy poziom miR206, w komórkach Pax7-/-, w porównaniu do komórek Pax7+/+. Z kolei w komórkach różnicujących in vivo, a więc w warunkach odzwierciedlających późniejsze etapy różnicowania, obserwowano niższą ekspresję wszystkich miRNA z rodziny miR1, a więc miR1, miR133a, miR133b, miR206. Uzyskane wyniki dowodzą, że choć ekspresja Pax7 nie jest niezbędna do powstania mioblastów mięśni szkieletowych z komórek ES, PAX7 pełni jednak istotną rolę w modulacji różnicowania miogenicznego poprzez regulację ekspresji miRNA.

miRNAs are important regulators of embryonic development. The role of these molecules in differentiation of various cell types, among them skeletal muscle myoblasts, is still being investigated. Presented analyses were performed using mouse embryonic stem cells (ES cells). These cells are pluripotent, which means they can become any given cell building adult organism. Two different cell lines were cultured in vitro in medium containing e.g. retinoic acid what induced myogenic differentiation. Expression of genes involved in pluripotency and myogenesis was then analyzed. High throughput analysis of miRNA expression has shown significant differences between two cell lines, among them were different expression of miR145 and miR181, molecules involved in differentiation of ES cells, and function of various cells like myoblasts. Significant differences in expression of miR206, myogenic miRNA specific for skeletal myoblasts, were observed in two analyzed cell lines. In the second part of this work transient miRNA overexpression was used to analyse the role of miRNAs in differentiation of ES cells. Synthetic miRNAs, among them miR145 or miR181 also miRNAs from myogenic miR1 family (miR1, miR133a, miR133b, miR206) were introduced into undifferentiated mouse ES cells. Next ES cells were differentiated in vitro, and the expression of genes and proteins involved in pluripotency and differentiation was analyzed. It was shown that transient miRNA overexpression can induce differentiation of ES cells. Among myogenic genes that were upregulated after miRNA overexpression were Pax3, Pax7, Myf5, Myog, Myod1, Myh2. In the third part, an analysis of the role of PAX7, a regulator of myogenesis, on the profile of miRNAs in ES cell lines was performed. Mouse embryonic stem cells that did not express functional PAX7 protein were used for this assay. In Pax7-/- ES cells differentiated in vitro, decreased expression of miR206 was observed. In cell cultured in vitro, early steps of myogenic differentiation can be observed. While in Pax7-/- mouse embryonic stem cells differentiated in vivo, decreased expression of miRNAs from the whole miR1 family (miR1, miR133a, miR13b, miR206) was observed. Differentiation of ES cells in vitro allows the observation of later stages of myogenic differentiation. These results prove that Pax7 can regulate myogenesis through modulating expression of miRNAs.