Impact of the regulator OmpR on iron homeostasis in the enteropathogen Yersinia enterocolitica

Wpływ regulatora OmpR na homeostazę żelaza u Yersinia enterocolitica Y. enterocolitica to Gram-ujemna pałeczka, ludzki enteropatogen, czynnik etiologiczny jersiniozy, odzwierzęcej choroby zakaźnej układu pokarmowego. Bakteria ta z powodzeniem kolonizuje różne nisze ekologiczne, a umiejętność przetrwania w zmiennych warunkach środowiska jest możliwa dzięki funkcjonowaniu wielu efektywnych mechanizmów regulatorowych, m. in. dwuskładnikowych systemów transdukcji sygnału (TCS). Żelazo jest jednym z istotniejszych mikroelementów niezbędnym dla metabolizmu podstawowego komórki bakteryjnej. Za utrzymanie prawidłowej homeostazy żelaza u bakterii odpowiada nadrzędny regulator Fur, który wiążąc Fe2+ ulega aktywacji i pełni funkcję represora m.in. genów systemów transportu żelaza. Niskie stężenie wolnego żelaza w środowisku sprawia, że bakterie korzystają z różnych strategii pozyskiwania tego pierwiastka. Kluczową rolę w asymilacji żelaza pełnią TonB-zależne receptory błony zewnętrznej, które rozpoznają i transportują kompleksy żelaza (Fe3+) z sideroforami, a także cząsteczki hemu, które są ważnym źródłem żelaza dla bakterii patogennych, kolonizujących organizm gospodarza. Przeprowadzone wcześniej różnicowe analizy proteomiczne błony zewnętrznej Y. enterocolitica Ye9 (bioserotyp 2/O:9) oraz analizy in silico genomu tego patogenu, w poszukiwaniu miejsc wiązania OmpR, pozwoliły na wytypowanie kilku genów receptorów transportu żelaza, których ekspresja może znajdować się pod kontrolą OmpR. Cztery miejsca wiązania o wysokiej homologii do sekwencji consensus dla OmpR zidentyfikowano również w promotorze genu fur. Niniejsza rozprawa doktorska miała na celu zweryfikowanie hipotezy, według której, OmpR Y. enterocolitica Ye9 regulując proces transkrypcji: (i) moduluje poziom represora Fur oraz (ii) bezpośrednio lub pośrednio wpływa na ekspresję genów regulonu Fur, tj. fepA kodującego receptor dla Fe3+-enterobaktyny, fecA dla Fe3+-dicytrynianu oraz hemR dla cząsteczki hemu. Badania wchodzące w skład prezentowanej rozprawy doktorskiej wykazały, że OmpR obniża poziom białka Fur, regulatora homeostazy żelazowej u Y. enterocolitica Ye9, w wyniku hamowania ekspresji genu fur na poziomie transkrypcji. Podobny mechanizm zaobserwowano również u E. coli. Ponadto OmpR może kontrolować transport żelaza u Y. enterocolitica Ye9 hamując ekspresję genu fepA oraz fecA, kodujących receptory błony zewnętrznej Y. enterocolitica uczestniczące w transporcie do komórki żelaza Fe3+, a także aktywując ekspresję operonu feoABC, kodującego system transportu FeoABC, zlokalizowany w błonie cytoplazmatycznej, który uczestniczy w pozyskiwaniu żelaza Fe2+. Przeprowadzone analizy wykazały również, że regulacja z udziałem OmpR zachodzi w wyniku bezpośredniego oddziaływania białka z sekwencjami regulatorowymi badanych genów/operonów. W toku badań dowiedziono, że szczep Y. enterocolitica Ye9 nie syntetyzuje własnych sideroforów, ale w warunkach deficytu żelaza może korzystać efektywnie z żelaza zawartego w cząsteczce hemu. Transport hemu jest możliwy dzięki obecności dwóch systemów transportu, kodowanych przez operony hemPRSTUV-1 (hem-1) i hemPRST-2 (hem-2), których ekspresja jest negatywnie regulowana przez żelazo, represor Fur oraz regulator OmpR. Białka HemR1 i HemR2 są funkcjonalnymi receptorami błony zewnętrznej, które odgrywają kluczową rolę w wychwytywaniu heminy i hemoglobiny. Badania prezentowane w pracy doktorskiej pozwoliły odkryć nieznane dotąd powiązanie między funkcjonowaniem regulatora OmpR a homeostazą żelaza, niezbędną do przeżycia bakterii w niszach ekologicznych, charakteryzujących się zmienną zawartością żelaza/hemu. OmpR kontrolując poziom represora Fur oraz jego aktywność, a także funkcjonowanie systemów transportu żelaza, może zapewniać optymalną dla metabolizmu komórkowego ilość żelaza/hemu, równocześnie zapobiegając jego toksycznej akumulacji.

Impact of the regulator OmpR on iron homeostasis in the enteropathogen Yersinia enterocolitica Y. enterocolitica is the Gram-negative rod, the etiological agent of yersiniosis, a digestive system's zoonotic infectious disease. This bacterium successfully colonizes various ecological niches, and the ability to survive in constantly changing environmental conditions is possible thanks to the functioning of many effective regulatory mechanisms, e.g., two-component signal transduction systems (TCS). Iron is one of the most critical micronutrients necessary for the primary metabolism of a bacterial cell. The precise control of iron homeostasis is coordinated by the Ferric uptake regulator (Fur). Active Fe2+-Fur acts as a repressor of genes responsible for iron acquisition, storage and utilization. Due to the low concentration of free iron in the environment, bacteria use various strategies for obtaining this element. A key role in iron assimilation is played by TonB-dependent outer membrane receptors that recognize and transport ferric iron (Fe3+) complexes with siderophores, as well as heme molecules, which are an essential source of iron for pathogenic bacteria that colonize the host organism. Previously conducted differential proteomic analyzes of the outer membrane of Y. enterocolitica Ye9 (bioserotype 2/O:9) and in silico analyzes of the genome of this pathogen, in search of OmpR binding sites, allowed for the selection of several iron transport receptor genes, the expression of which may be under the control of OmpR. Four binding sites with high homology to the consensus sequence for OmpR have also been identified in the fur gene promoter region. This doctoral dissertation was aimed to verify the hypothesis that OmpR of Y. enterocolitica Ye9 by regulation of the transcription process: (i) modulates the level of the Fur repressor and (ii) directly or indirectly influences the expression of Fur regulon genes, i.e., fepA encoding the receptor for Fe3+-enterobactin, fecA for Fe3+-dicitrate and hemR for the heme molecule. The research presented in the doctoral dissertation has shown that OmpR reduces the level of Fur protein, a regulator of iron homeostasis in Y. enterocolitica Ye9, as a result of inhibition of fur gene expression at the transcription level. A similar mechanism was also observed in E. coli. In addition, OmpR can control iron transport in Y. enterocolitica Ye9 by inhibiting the expression of the fepA and fecA genes encoding the Y. enterocolitica outer membrane receptors involved in transport of ferric iron (Fe3+) into the cell, and by activating the expression of the feoABC operon, encoding the FeoABC transport system, localized in the cytoplasmic membrane, which is involved in obtaining ferrous iron (Fe2+). The conducted analyses also showed that regulation with the participation of OmpR occurs due to the direct interaction of the protein with the regulatory sequences of the studied genes/operons. In the course of the research, it was proved that the Y. enterocolitica Ye9 strain does not synthesize siderophores, but in conditions of iron deficiency, it can effectively use the iron contained in the heme molecule. Heme transport is possible due to the presence of two transport systems, encoded by the hemPRSTUV-1 (hem-1) and hemPRST-2 (hem-2) operons, the expression of which is negatively regulated by iron, the Fur repressor and the OmpR regulator. The HemR1 and HemR2 proteins are functional outer membrane receptors that play a crucial role in hemin and hemoglobin uptake. The research presented in the doctoral dissertation has discovered a previously unknown connection between the functioning of the OmpR regulator and iron homeostasis, necessary for the survival of bacteria in ecological niches characterized by variable iron/heme content. By controlling the Fur repressor level and its activity, as well as the functioning of iron transport systems, OmpR can provide the optimal amount of iron/heme for cellular metabolism while preventing its toxic accumulation.