Wpływ wybranych regulatorów miogenezy na pluripotencję i różnicowanie zarodkowych komórek macierzystych

Mięśnie szkieletowe mają zdolność do regeneracji po uszkodzeniu dzięki obecnym w nich komórkom macierzystym określanym jako komórki satelitowe (KS). Pomimo obecności KS, w przypadku rozległych lub powtarzających się urazów może dojść do utraty prawidłowej struktury i funkcjonalności mięśnia. Jedną z proponowanych terapii dysfunkcjonalnych mięśni szkieletowych jest transplantacja mioblastów i KS uzyskanych z komórek macierzystych. Ze względu na potencjał do wielokierunkowego różnicowania, a także zdolność do nieograniczonych podziałów pluripotencjalne komórki macierzyste (PSC) są rozważane jako źródło komórek do przeszczepu w takich terapiach. Choć badania nad opracowaniem wydajnego protokołu różnicowania PSC w mioblasty i KS prowadzone są od kilkudziesięciu lat, dotychczas nie udało się opracować protokołu, który umożliwiałby szybkie, wydajne i powtarzalne różnicowanie tych komórek w mioblasty, w pełni zdefiniowanych warunkach, tj. bez czynników pochodzenia zwierzęcego. Jedną z proponowanych metod indukcji różnicowania miogenicznego PSC jest prowadzenie hodowli w obecności regulatorów miogenezy. W ten nurt badań wpisują się doświadczenia opisane w niniejszej rozprawie doktorskiej. Celem mojej pracy doktorskiej była weryfikacja hipotezy badawczej mówiącej, że: w zdefiniowanych warunkach hodowli wybrane regulatory miogenezy, takie jak białka Wnt, sonic hedgehog i interleukina-4, promują mezodermalne i miogeniczne różnicowanie mysich zarodkowych komórek macierzystych (ESC). Zrealizowane przeze mnie badania objęły: (1) porównanie wpływu pożywki o zdefiniowanym składzie chemicznym i pożywki z dodatkiem surowicy na pluripotencję i różnicowanie mysich ESC; (2) analizę wpływu czynników Wnt na pluripotencję i różnicowanie mysich ESC; (3) analizę wpływu Shh na pluripotencję i różnicowanie mysich ESC; (4) analizę wpływu IL-4 na pluripotencję i różnicowanie mysich ESC. W pierwszej części badań sprawdzono, jak pożywka o zdefiniowanym składzie wpłynie na właściwości ESC różnicujących w kulach zarodkowych (EB). W tym celu przeprowadzono analizę cyklu komórkowego komórek hodowanych w pożywce z dodat-kiem zamiennika surowicy (SR) o zdefiniowanym składzie chemicznym, a także komórek hodowanych w pożywce z dodatkiem płodowej surowicy bydlęcej (FCS), standardowo używanej do hodowli ESC. Sprawdzono także poziom ekspresji markerów: pluripotencji, listków zarodkowych, różnicujących komórek wywodzących się z trzech listków zarodkowych oraz przejścia nabłonkowo-mezenchymalnego. Wykazano, że ESC hodowane w pożywce SR preferencyjnie różnicują w ektodermę natomiast nie różnicują wydajnie w endo- i mezodermę. W drugiej części badań określono poziom ekspresji czynników Wnt w niezróżnicowanych ESC i EB hodowanych w każdej z ww. pożywek. Wykazano, że żaden z czynników Wnt nie jest charakterystyczny dla niezróżnicowanych ESC, a w różnicujących ESC wysoki poziom ekspresji markerów mezodermy koreluje z wysokim poziomem ekspresji Wnt11. Wykazano również, że egzogenny Wnt11 promuje ekspresję markerów mezodermy (T, Pax3), a także hamuje ekspresję markerów ektodermy (Pax6) i, nieznacznie, endodermy (Gata4) w ESC hodowanych w pożywce SR. W trakcie dalszych badań stwierdzono, że mezodermalne różnicowanie ESC wymaga zarówno aktywacji kanonicznej, jak i niekanonicznej ścieżki Wnt. W trzeciej części badań określono wpływ Shh na pluripotencję i różnicowanie ESC. Wykazano, że EB hodowane w pożywce SR charakteryzuje wysoki poziom aktywności ścieżki sygnałowej zależnej od Shh, co koreluje z wydajnym różnicowaniem ESC w ektodermę w takich warunkach hodowli. W przypadku ESC hodowanych w pożywce FCS obecność egzogennego Shh promowała wzrost ekspresji markerów ektodermy (Pax6). Z kolei w EB w pożywce SR traktowanie Shh prowadziło do spadku ekspresji markerów endo- i mezodermy (Gata4, T). W czwartej części badań sprawdzono, jak IL-4 wpłynie na poziom ekspresji markerów pluripotencji i różnicowania w ESC, a także ich zdolnośc do fuzji. Wykazano, że IL-4 nie wpływa znacząco na poziom ekspresji analizowanych białek błonowych, tj. Vcam1, Cdh15, Itga4 i Itgb1 natomiast prowadzi do znaczącego wzrostu ekspresji markerów mezodermy przedsomitowej (Msgn1) i komórek prekursorowych mioblastów (Pax3, Pax7).

Skeletal muscles are able to regenerate after injury thanks to the satellite cells, skeletal muscle stem cells. However, in case of massive or reoccurring injuries damaged muscle may not be reconstructed efficiently, leading to its impaired structure and functionality. It is proposed that myoblasts and satellite cells derived from stem cells could improve functionality of such muscles. Due to multidirectional differentiation potential and unlimited ability for self-renewal pluripotent stem cells (PSC) are considered as a potential source of cells for transplantation in such therapies. Despite numerous attempts no protocol enabling fast, efficient, and reproducible myogenic differentiation of PSC under defined cultured conditions, i.e. without animal-derived supplements, has been designed to this date. One of the strategies to reach this goal is culture of PSC in the presence of factors that are involved in the regulation of embryo myogenesis. The results presented in this thesis belong to such scientific area. In the presented thesis the following hypothesis: selected myogenesis regulators, such as Wnts, sonic hedgehog or interleukin-4 promote mesodermal and myogenic ESC differentiation under defined conditions was verified. The experiments were divided into four stages: (1) the analysis of the impact of chemically-defined culture medium and medium supplemented with serum on ESC pluripotency and differentiation; (2) the analysis of the influence of Wnt factors on ESC pluripotency and differentiation; (3) the analysis of the influence of Shh on ESC pluripotency and differentiation; (4) the analysis of the influence of IL-4 on ESC pluripotency and differentiation. First, it was studied how culture medium influences ESC differentiating in EB. To this end, cell cycle progression and expression of pluripotency and differentiation, as well as EMT markers, was studied in EB cultured in medium supplemented with chemically-defined serum replacement (SR) or FCS (commonly used for ESC culture). It was demonstrated that EB cultured in SR medium differentiate into ectoderm efficiently, but not into endo- and mesoderm. Secondly, the expression of Wnt factors was studied in undifferentiated ESC and EB cultured in both media. No Wnt was specific for undifferentiated ESC. Wnt11 was expressed at higher levels in cells expressing high levels of mesodermal markers. In subsequent analyses, Wnt11 was demonstrated to induce expression of mesodermal markers (T, Pax3), and decrease expression of ecto- (Pax6) and endoderm (Gata4) markers in SR medium. Additionally, it was shown that both canonical and Wnt/JNK noncanonical pathways are crucial for ESC differentiation into mesoderm. Next, the influence of Shh was analysed. It was observed that EB cultured in SR medium are characterized by high levels of Shh pathway activity. Additionally, exogenous Shh promotes expression of ectoderm marker in EB in FCS medium (Pax6) and decreases the expression of endo- and mesoderm markers in EB in SR medium (Gata4, T). In the final set of experiments, the influence of IL-4 on ESC ability to fuse and differentiation was studied. It was demonstrated that IL-4 does not affect the expression on cell membrane proteins, such as Vcam1, Cdh15, Itga4 and Itgb1. However, this cytokine does influence the expression of presomitic mesoderm (Msgn1) and myoblast precursor cells (Pax3, Pax7).