Methylglyoxal metabolism in ammonium-treated Arabidopsis plants

Azot jest makroelementem niezbędnym do prawidłowego wzrostu i rozwoju roślin. Głównymi nieorganicznymi formami azotu pobieranymi przez rośliny z podłoża są azotany (NO3-) lub jony amonowe (NH4+). Asymilacja jonów amonowych jest korzystniejsza pod względem energetycznym, jednak dostępność NH4+ jako jedynego źródła azotu prowadzi do zahamowania wzrostu roślin oraz występowania symptomów toksyczności, co zostało określone jako syndrom amonowy. Istnieje wiele hipotez dotyczących przyczyn występowania syndromu amonowego. Hipoteza testowana w niniejszej pracy doktorskiej zakładała, że jednym z czynników odpowiedzialnych za występowanie syndromu amonowego jest wzmożona produkcja toksycznego metyloglioksalu (MG) pod wpływem żywienia amonowego. Materiał badawczy stanowił rzodkiewnik pospolity (Arabidopsis thaliana) rosnący w kulturach hydroponicznych na pożywce zawierającej azotany lub jony amonowe jako jedyne źródło azotu. W niektórych eksperymentach wykorzystano również hodowle in vitro rzodkiewnika, co pozwalało na pokazanie zmian wywołanych krótkotrwałym działaniem NO3- lub NH4+ na rośliny. Metyloglioksal powstaje głównie jako produkt uboczny szlaku glikolitycznego, dlatego też w pierwszym etapie badań wykazano, że żywienie amonowe prowadzi do zwiększenia aktywności procesu glikolizy. Następnie udowodniono, że żywienie amonowe prowadzi do zwiększonego stężenia MG w tkankach roślin oraz do aktywacji ścieżki detoksyfikacji MG, na którą składa się zależny od glutationu szlak glioksalaz oraz dehydrogenaza D-mleczanowa (D-LDH). Głównymi izoformami glioksalaz (GLX), których ekspresja wzrastała pod wpływem żywienia amonowego były GLXI.3 oraz GLXII.5. Dlatego do dalszych badań użyto mutantów insercyjnych glx.I.3 i glxII.5. Udowodniono, że aktywność izoformy GLXI.3 ma kluczowe znaczenie dla prawidłowego funkcjonowania szlaku detoksyfikacji MG podczas hodowli na jonach amonowych. Natomiast brak aktywności GLXII.5 był kompensowany przez aktywność innych izoform GLXII. Przeprowadzono również analizę metabolizmu MG u mutanta rzodkiewnika frostbite1 (fro1), który charakteryzuje się mniejszą wrażliwością na żywienie amonowe. Wykazano, że w warunkach żywienia azotanowego rośliny fro1 mają wyższe stężenie MG w porównaniu do roślin typu dzikiego. Jednak w warunkach żywienia amonowego stężenie MG było znacznie niższe u roślin fro1 niż u roślin typu dzikiego, co prawdopodobnie wynikało ze zwiększonej aktywności szlaku glioksalaz. Ponadto rośliny fro1 rosnące w obecności NH4+ wykazywały wyższy poziom utleniania mitochondrialnego D-mleczanu, który jest produktem szlaku glioksalaz. Mutanty fro1 były również mniej wrażliwe niż rośliny typu dzikiego na egzogenny MG. Reasumując, zwiększona aktywność szlaku detoksyfikacji oraz wydajny proces utleniania D-mleczanu są prawdopodobną przyczyną zwiększonej odporności fro1 na żywienie amonowe. Ponieważ wiadomo, że MG oraz produkt pośredni jego katabolizmu (S D laktyloglutation) mają wpływ na metabolizm potasu (K) w innych organizmach zbadano również wpływ metabolizmu MG na homeostazę K+ u rzodkiewnika. Wykazano, że żywienie amonowe powodowało spadek stężenia potasu w tkankach oraz spadek ekspresji wybranych genów, których produkty są odpowiedzialnych za pobieranie oraz dystrybucję K+. Szkodliwy wpływ metabolizmu MG na poziom K+ w tkankach został potwierdzony z użyciem mutantów glxI.3 oraz glxII.5 hodowanych w warunkach żywienia amonowego. W badanych mutantach deficyt potasu był znacznie wyższy w porównaniu do roślin typu dzikiego. Wykazano, że traktowanie siewek rzodkiewnika egzogennym MG lub inhibitorem aktywności GLXI powodowało obniżenie ekspresji KEA1, kodującego jeden z transporterów K+ odpowiedzialnych za dystrybucję wewnątrzkomórkową potasu. Na podstawie wyników zawartych w prezentowanej rozprawie doktorskiej można stwierdzić, że zwiększona produkcja MG spowodowana obecnością jonów amonowych w podłożu jest kluczowym czynnikiem wpływającym na występowanie symptomów syndromu amonowego.

Nitrogen (N) is an important macroelement related to plant growth and development. The primary inorganic forms of N taken up by plants are nitrate (NO3-) and ammonium ions (NH4+). Ammonium assimilation costs substantially less energy than nitrate assimilation, but surprisingly when ammonium is supplied as the only nitrogen source for plants, growth inhibition and toxicity symptoms are observed, which are commonly referred to as the ammonium syndrome. There have been several hypotheses proposed to explain why plants develop ammonium syndrome. This PhD thesis tested whether formation of toxic methylglyoxal (MG) in response to ammonium nutrition, is an important factor responsible for ammonium syndrome. The main research material was Arabidopsis thaliana plants grown in hydroponic cultures for eight weeks in the presence of either nitrates (control) or ammonium as the sole N sources. Additionally, some short-term experiments were performed using in vitro cultured Arabidopsis in nitrate- or ammonium-containing media. Since MG is produced predominantly as a by-product of glycolysis, it was confirmed that glycolytic flux was up-regulated in ammonium-grown plants. Next, using biochemical and molecular methods it was shown that ammonium nutrition led to an increased MG level and a simultaneous activation of an MG-detoxification route catalyzed by a glutathione-dependent glyoxalase (GLX) pathway and D lactate dehydrogenase (D-LDH). The main isoforms of GLXs that were upregulated by ammonium were GLXI.3 and GLXII.5; therefore, insertional mutants glx.I.3 and glxII.5 were chosen for in-depth analyses. GLXI.3 isoform activity was proven to be crucial in determining the proper functioning of the MG-detoxification process under ammonium nutrition, and a lack of GLXII.5 activity was shown to be compensated by the upregulation of other GLXII isoforms. The characterization of MG metabolism in frostbite1 (fro1) Arabidopsis mutants with increased ammonium nutrition resistance was also included in the research. Under nitrate conditions, the MG level was elevated in fro1 plants as compared to wild-type plants; however, under ammonium nutrition MG concentration was much lower in fro1 plants than in wild-type plants primarily due to the greatly enhanced activity of the GLX pathway. Additionally, ammonium-grown fro1 plants were characterized by significantly higher rates of mitochondrial oxidation of D-lactate which is a product of the GLX route. Furthermore, fro1 plants were less sensitive to externally applied MG than their wild-type counterparts. Overall, the enhanced activity of the MG detoxification pathway and effective mitochondrial step of D-lactate oxidation seemed to assist in the fro1 plants overcoming the ammonium toxicity symptoms. Since MG and the by-product of its catabolism, that is, S-D-lactoylglutathione (SLG), were shown to have an impact on potassium (K) metabolism in other organisms, the influence of MG metabolism on Arabidopsis K+ homeostasis was also studied. Tissue K deficiency and a decrease in the expression of several proteins responsible for K+ uptake and distribution in response to ammonium nutrition were found in Arabidopsis plants. Furthermore, the detrimental impact of MG metabolism on plant tissue K+ status was proven using glx.I.3 and glxII.5 mutants grown under ammonium conditions. In these plants, K deficits were much higher than those in wild-type plants. It was also shown that exogenous treatment of Arabidopsis tissues with MG or GLXI activity inhibitor resulted in a decrease in the expression of KEA1, one of the transporters responsible for K+ cellular distribution. Overall, the results of this PhD thesis have proven that the increased production of MG under ammonium nutrition is an important factor contributing to ammonium syndrome symptoms.