Rola szlaku Ubikwityna-Proteasom w regulacji aktywności czynników transkrypcyjnych Gli

Ścieżka Hedgehog (Hh) jest jednym z najważniejszych szlaków sygnalizacyjnych w procesach rozwojowych, począwszy od rozwoju zarodkowego, przez organogenezę, po kontrolę procesów regeneracyjnych w organizmach dorosłych. Zaburzenia w prawidłowym funkcjonowaniu ścieżki Hh mogą prowadzić do poważnych wad rozwojowych, jak również do powstawania nowotworów, w tym rdzeniaka zarodkowego – najczęstszego nowotworu złośliwego mózgu występującego u dzieci. Sygnalizacja Hh kontroluje procesy fizjologiczne i chorobowe poprzez czynniki transkrypcyjne Gli (ang. Glioma-associated oncogene), które są odpowiedzialne za regulację ekspresji genów docelowych ścieżki. Dla prawidłowego funkcjonowania szlaku Hh, kluczowa jest jej precyzyjna regulacja, a w szczególności regulacja aktywności czynników transkrypcyjnych Gli. Proteasomalna degradacja białek Gli jest fundamentalna w tym procesie. Gdy ścieżka Hh jest nieaktywna, białka Gli są przekształcane do form represorowych (GliR) w wyniku częściowej degradacji w proteasomie. Natomiast, aktywacja ścieżki skutkuje wytworzeniem form aktywatorowych białek Gli (GliA) przy jednoczesnym zahamowaniu powstawania GliR. Poziom aktywacji ścieżki Hh jest kontrolowany przez całkowitą degradację GliA. Dotychczasowe badania wskazywały, że aktywność proteasomu jest niezbędna dla zahamowania aktywności białek Gli. Jednakże badania wstępne przeprowadzone w naszym laboratorium wykazały, że aktywność proteasomu może być również niezbędna w procesie aktywacji białek Gli. Na podstawie przeprowadzonych doświadczeń i analizy danych literaturowych postawiłem hipotezę o zaangażowaniu proteasomu w proces aktywacji białek Gli.

Niniejsza dysertacja została przygotowana z wykorzystaniem zaawansowanych technik biologii molekularnej, m.in. mutagenezy CRISPR/Cas9 oraz transdukcji wirusowej, technik analitycznych z uwzględnieniem mikroskopii fluorescencyjnej oraz cytometrii przepływowej, a także innowacyjnej techniki proteomicznej TurboID. Prace doświadczalne prowadzono z wykorzystaniem mysiej modelowej linii szlaku Hh NIH-3T3, mysiej linii rdzeniaka zarodkowego Daoy oraz ludzkiej linii HEK293. Aktywność ścieżki Hh badano z wykorzystaniem szerokiego wachlarza technik obejmujących próbę lucyferazową, analizę ekspresji genów docelowych na poziomie mRNA (RT-qPCR) oraz białka (western blot), a także stworzony na potrzeby niniejszej pracy system reporterowy indukujący ekspresję białka GFP pod kontrolą promotora Gli.

Na podstawie badań przeprowadzonych w ramach projektu doktorskiego wykazano, że aktywność proteasomu jest niezbędna dla prawidłowej aktywacji ścieżki Hh. Wnikliwa analiza tego procesu z zastosowaniem inhibitorów proteasomu ujawniła, że proteasom pełni kluczową rolę w aktywacji wszystkich białek Gli. Następnie, w celu ustalenia ligazy ubikwityny zaangażowanej w ten proces, przeprowadzono szereg badań przesiewowych, które potwierdziły zaangażowanie kompleksu ubikwitynującego Cul3 z rodziny kullin. W wyniku dalszych badań odkryłem, że dwie ligazy ubikwityny Kctd3 oraz Btbd9, które tworzą kompleksy z Cul3, pełnią rolę pozytywnych regulatorów szlaku Hh. Ponadto w ramach realizacji projektu badawczego uzyskano zbiór białek oddziałujących z białkiem Gli2, w którym wykryto białka, których charakter oddziaływania z Gli2 zmieniał się pod wpływem inhibicji proteasomu, a także białka i kompleksy, które nie były dotąd łączone z sygnalizacją Hh.

Opisany w niniejszej pracy proces hamowania aktywności ścieżki Hh poprzez inhibicję proteasomu wypełnia istotną lukę w naszym rozumieniu udziału proteasomu w regulacji sygnalizacji wewnątrzkomórkowej. Badania ujęte w przedstawionej rozprawie doktorskiej dowodzą, że ubikwitynacja z udziałem kompleksu Cul3 jest niezbędna dla prawidłowej aktywacji ścieżki Hh oraz ukazują nieznane dotąd aspekty regulacji szlaku. Uzyskane wyniki mogą w przyszłości przyczynić się do rozwoju nowoczesnych terapii zwalczających choroby nowotworowe związane z nieprawidłową aktywacją ścieżki Hh.

The Hedgehog signaling pathway (Hh) is one of the key cascades regulating a wide array of cellular processes, from embryonic development to organogenesis and tissue regeneration in adults. Disruption of this pathway can result in developmental abnormalities and malignancies, such as medulloblastoma, the most common malignant solid brain tumor in children. Hh signaling governs cellular and physiological processes through the Gli (Glioma-associated oncogene) family of transcription factors, which mediate the expression of target genes. Precise regulation of the Hh pathway - and especially the activation of Gli proteins - is essential for its proper function. Proteasomal degradation plays a crucial role in this process. In the absence of the Hh signaling, Gli proteins undergo proteasomal truncation to generate their repressor forms (GliR). In contrast, pathway activation promotes the generation of active Gli proteins (GliA) while simultaneously inhibiting GliR formation. The degree of Hh pathway activation is regulated by the proteasomal degradation of GliA. Until now, studies have shown that proteasomal activity is necessary to inhibit Hh pathway. However, the preliminary research conducted for this project has led to the hypothesis that proteasome activity may also be essential for the activation of Gli proteins.

This work was conducted using state-of-the-art molecular biology techniques, including CRISPR/Cas9 mutagenesis and viral transductions, complemented by analytical methods such as fluorescent microscopy and flow cytometry, as well as the innovative proteomic approach TurboID. The experiments were performed on murine NIH-3T3 cells, a known Hh signaling model, the Daoy medulloblastoma cell line, and HEK293 cells. The activity of the Hh pathway was assessed using a variety of techniques, including a luciferase reporter array, analysis of target gene expression at both mRNA and protein levels, as well as a reporter system developed for this study that induces GFP expression under a Gli promoter element.

The studies presented in this work demonstrate that proteasome activity is indeed required for the Hh pathway activation. In-depth analysis of this process using proteasome inhibitors revealed the essential role of the proteasome in Gli proteins activation. Subsequent screening experiments uncovered the involvement of a Cul3 ubiquitin ligase complex. Further investigation identified Kctd3 and Btbd9 as the ubiquitin ligases that form complexes with Cul3 and act as novel positive Hh pathway regulators. Furthermore, a Gli2 interactome was generated during the work on this thesis, which revealed subsets of proteins whose interactions were altered by proteasome inhibition. Additionally, this analysis uncovered novel proteins and complexes that haven’t been linked to Hh pathway until now.

The process of Hh pathway downregulation mediated by the proteasomal inhibition described in this thesis fills an important gap in our understanding of how proteasome activity contributes to the intracellular signaling regulation. The research included in this work demonstrates that Cul3-dependent ubiquitination is necessary for proper activation of the Hh pathway. These findings uncover previously unknown aspects of Hh pathway regulation and may contribute to the development of innovative therapies against Hh-driven carcinomas in the future.