The role of cytoplasmic polyadenylation in the immune response

Post-transkrypcyjna regulacja ekspresji genów odgrywa istotną rolę zarówno w odpowiedzi immunologicznej nabytej jak i wrodzonej. Wśród modyfikacji post transkrypcyjnych, poliadenylacja odgrywa kluczową rolę w determinowaniu losów mRNA. Jest to etap obróbki polegający na dodaniu niekodowanych adenin (ogona poli[A]) do 3’ końca RNA przez kanoniczne polimerazy poli(A), zachodzący tuż po transkrypcji w jądrze komórkowym. Ogon poli(A) jest niezbędny do eksportu mRNA z jądra do cytoplazmy, wpływa na proces translacji oraz stabilność mRNA. Dodatkowo, istniejące ogony poli(A) mogą być wydłużane w cytoplazmie przez niekanoniczne polimerazy poli(A). W obrębie niekanonicznych polimeraz poli(A) wyróżniamy niedawno zidentyfikowaną rodzinę TENT5 (wcześniej znana jako FAM46), która u ludzi występuje w postaci 4 paralogów: TENT5A, B, C i D. Dotychczasowe badania wskazują, że są to aktywne cytoplazmatyczne polimerazy poli(A). Najlepiej zbadanym członkiem tej rodziny jest TENT5C, jako że gen TENT5C jest jednym z najczęściej mutowanych genów u pacjentów ze szpiczakiem mnogim, nowotworem komórek plazmatycznych produkujących przeciwciała. Nie opisano jednak jak dotąd roli cytoplazmatycznej poliadenylacji w komórkach układu immunologicznego. Dlatego też, celem mojej rozprawy doktorskiej było zbadanie roli cytoplazmatycznej poliadenylacji katalizowanej przez białka z rodziny TENT5 zarówno w odpowiedzi immunologicznej wrodzonej, na modelu makrofagów, gdzie wyrażane są białka TENT5A i TENT5C (Liudkovska et al., w recenzji) oraz odpowiedzi swoistej na modelu limfocytów B, gdzie ulega ekspresji tylko TENT5C (Bilska et al., 2020). Stosując bezpośrednie sekwencjonowanie RNA w technologii Nanopore wykazałam, że transkrypty kodujące immunoglobuliny są głównymi substratami TENT5C w aktywowanych limfocytach B, jako że wykazują one specyficzne skrócenie długości ogonów w komórkach Tent5c-/- względem komórek typu dzikiego. Wykazałam, że poliadenylacja przez TENT5C prowadzi do zwiększonej stabilności tych transkryptów a w konsekwencji ich zwiększonej ekspresji na poziomie mRNA i białka. Myszy Tent5c-/- produkują mniej przeciwciał i wykazują obniżoną odpowiedź immunologiczną na immunizację antygenem T niezależnym. TENT5C wpływa także bezpośrednio na fizjologię limfocytów B, jako że komórki Tent5c-/- szybciej proliferują i różnicują do komórek plazmatycznych. Dodatkowo, limfocyty B Tent5c-/- mają mniejszą objętość siateczki śródplazmatycznej i dynamikę jej ekspansji po aktywacji komórek, oraz osłabioną odpowiedź na indukcję stresu siateczki śródplazmatycznej jak wskazuje analiza qPCR poziomu ekspresji markerów stresu siateczki. Aby zbadać substraty białek TENT5A i TENT5C w aktywowanych makrofagach, ze względu na to, myszy z podwójną mutacją Tent5a-/- Tent5c-/- rodzą się ekstremalnie rzadko, wyprowadziliśmy linię myszy pozbawioną genu Tent5c i pozwalającą na indukowane wycięcie genu Tent5a (Tent5aflox/floxTent5c-/- ). Następnie zoptymalizowałam wycięcie Tent5a za pomocą rekombinazy Cre wprowadzonej na wektorze lentiwirusowym i przeprowadziłam bezpośrednie sekwencjonowanie RNA z aktywowanych makrofagów typu dzikiego oraz pozbawionych TENT5A i TENT5C. Wykazałam, że TENT5A i TENT5C przeprowadzają cytoplazmatyczną poliadenylację transkryptów kodujących lizozym i inne białka wydzielane zaangażowane w odpowiedź immunologiczną u makrofagów, w konsekwencji zwiększając poziom ekspresji tych białek. Podsumowując, prezentowane przeze mnie wyniki wskazują na istotną rolę cytoplazmatycznej poliadenylacji w odpowiedzi immunologicznej. Cytoplazmatyczna poliadenylacja transkryptów immunoglobulin przez TENT5C w limfocytach B zwiększa stabilność tych mRNA, powodując zwiększoną ekspresję immunoglobulin, wpływając bezpośrednio na odpowiedź humoralną tych komórek. Z kolei białka TENT5A oraz TENT5C w makrofagach poliadenylują transkrypty kodujące białka wydzielane, związane z odpowiedzią immunologiczną wrodzoną, zwiększając poziom ich ekspresji, tym samym modulując odpowiedź immunologiczną.

Post-transcriptional regulation of gene expression plays an important role in both adaptive and innate immune responses. Among post-transcriptional modifications, polyadenylation plays a crucial role in determining mRNA fate. It is a processing step involving the addition of a stretch of non-templated adenosines (the poly[A] tail) to the RNA 3' end by canonical poly(A) polymerases that take place imminently after transcription in the nucleus. The poly(A) tail is essential for the export of mRNA from the nucleus to the cytoplasm and affects its translation and stability. Additionally, the already existing poly(A) tails can be elongated in the cytoplasm by non-canonical poly(A) polymerases. Among non-canonical poly(A) polymerases, we distinguish the recently identified TENT5 family (formerly known as FAM46), which in humans consists of 4 paralogues: TENT5A, B, C, and D. Previous studies indicate that they are active cytoplasmic poly(A) polymerases. The best-studied member of this family is TENT5C, as the TENT5C gene is one of the most frequently mutated genes in patients with multiple myeloma, a cancer of antibody-producing plasma cells. The role of cytoplasmic polyadenylation in immune cells has not yet been described. Thus, my PhD thesis aimed to investigate the role of cytoplasmic polyadenylation catalyzed by TENT5 family proteins in both innate immune response, working on a macrophage model, where TENT5A and TENT5C proteins are expressed (Liudkovska et al., in review) and adaptive response using a B lymphocyte model, where only TENT5C is expressed (Bilska et al., 2020). Using direct RNA sequencing with Nanopore technology, I have shown that transcripts encoding immunoglobulins are the major substrates of TENT5C in activated B lymphocytes, as they present a specific shortening of tail length in Tent5c-/- cells relative to wild-type cells. Additionally, I have shown that polyadenylation by TENT5C leads to increased stability of these transcripts and, consequently, their increased steady-state mRNA and protein level. Tent5c-/- mice produce fewer antibodies and have a diminished immune response to immunization with T-independent antigen. TENT5C also directly affects B lymphocyte physiology, as Tent5c-/- cells proliferate faster and differentiate more rapidly into plasma cells. In addition, Tent5c-/- B lymphocytes have lower endoplasmic reticulum volume and expansion dynamics after cell activation and weakened response to the induction of endoplasmic reticulum stress as indicated by qPCR analysis of expression levels of reticulum stress markers. To investigate the substrates of TENT5A and TENT5C proteins in activated macrophages, as mice with the Tent5a-/- Tent5c-/- double mutation are born extremely rarely, we have generated a mouse line lacking the Tent5c gene and allowing inducible excision of the Tent5a gene (Tent5aflox/floxTent5c-/- ). I then optimized Tent5a excision using Cre recombinase introduced on a lentiviral vector and performed direct RNA sequencing from activated wild type and TENT5A- and TENT5C-deficient macrophages. I showed that TENT5A and TENT5C catalyze cytoplasmic polyadenylation of transcripts encoding lysozyme and other secreted proteins involved in the immune response in macrophages, consequently increasing their protein levels. In summary, the results I have presented indicate an important role of cytoplasmic polyadenylation in the immune response. Cytoplasmic polyadenylation of transcripts encoding immunoglobulins by TENT5C in B cells increases the stability of these mRNAs, leading to the increased expression of immunoglobulins, directly affecting the humoral response of these cells. In turn, TENT5A and TENT5C proteins in macrophages polyadenylate transcripts that encode secreted proteins associated with the innate immune response, increasing their expression levels, thereby modulating the immune response.