The role of the main lipoprotein chloroplastic compartments in response to abiotic stress conditions

Chloroplasty roślin wyższych, w których zachodzi proces fotosyntezy, zawierają wysoko wyspecjalizowany i aktywnie współpracujący ze sobą zespół lipoproteinowych skład- ników, do których należą błony tylakoidów i plastoglobule. Błony tylakoidów zorgani- zowane są w grana (obszary ścieśnione) i łączące je tylakoidy stromy (obszary nieścieśnione). Taki typ organizacji przestrzennej wynika z ich unikatowego składu białkowo- lipidowego oraz niejednorodnego rozmieszczenia kompleksów chlorofilowo-białkowych wewnątrz błon, co sprzyja stabilizacji struktury chloroplastów, jednocześnie zachowując dużą elastyczność i zdolność adaptacji do dynamicznie zmieniających się warunków środowiska. Plastoglobule to małych rozmiarów A (30 nm–5 μm) kuliste struktury, za- wierające w swym wnętrzu lipidy o charakterze neutralnym oraz liczne białka struktu- ralne i enzymatyczne zakotwiczone w otaczającej je pojedynczej błonie, która wykazuje ciągłość z błoną tylakoidów. W ostatnich latach analiza składu białkowo-lipidowego plastoglobul wykazała, iż są one rezerwuarem zarówno materiałów zapasowych w chlo- roplastach, jak i miejscem zachodzenia wielu reakcji metabolicznych. Ścisłe poł ączenie plastoglobul z błonami tylakoidów pozwala na aktywną wymianę metabolitów między obiema strukturami.Ponadto wszelkie zmiany w funkcjonalności błon tylakoidów wywo- łane działaniem stresów abiotycznych wpływają także na plastoglobule, modyfikuj ąc ich strukturę, rozmiar i ilość w chloroplaście. Jednak charakter tych zmian nie został jeszcze poznany. Niniejsza praca doktorska koncentruje się na wyjaśnieniu roli lipoproteinowych składni- ków chloroplastu, z wyszczególnieniem błon tylakoidów i plastoglobul, w odporności roślin na stresy abiotyczne. Głównym celem pracy jest próba scharakteryzowania składni- ków białkowych i/lub lipidowych w błonach tylakoidów i w plastoglobulach zwi ązanych z odpornością roślin na stres chłodu i światła oraz potencjalnych mechanizmów odpowie- dzialnych za zdolności adaptacyjne roślin do niekorzystnych warunków ́srodowiska. W tym celu przeprowadzono: analizę funkcjonalną błon tylakoidowych (fluorescencja 77 K i pomiary aktywności fotosyntetycznej dzięki Dual-PAM), analizę składu białkowego (elektroforeza Native-PAGE, Western-blot) oraz lipidowego (wysokosprawna chromato- grafia cieczowa – HPLC) tylakoidów i plastoglobul, analizę własności fizycznych błon (płynność błony) otrzymanych plastoglobul i tylakoidów, oddziaływań białka-białka, lipidy-lipidy i białka-lipidy mierzonych w podczerwieni (spektroskopia absorpcyjna w za- kresie podczerwieni – FTIR) zarówno dla plastoglobul jak i tylakoidów, analizę organizacji przestrzennej i wielkości plastoglobul dostępnymi technikami mikroskopowymi (flu- orescencyjna mikroskopia konfokalna – CLSM, transmisyjna mikroskopia elektronowa – xi TEM, mikroskopia sił atomowych – AFM) w tym zbadanie sprężystości plastoglobul jako jednego z czynników fizycznych definiujących kształt i wielkość obiektów. Wyniki przeprowadzonych doświadczeń i analiz przedstawione zostały w formie opu- blikowanych bądź złożonych do druku artykułów, stanowiących poszczególne rozdziały pracy doktorskiej. Szczegółowa charakterystyka plastoglobul, niedocenionych składników lipoproteino- wych w chloroplastach, a także uzyskane dane na temat zmian w ich strukturze i składzie zarówno w warunkach kontrolnych, jak i podczas stresu u dwóch gatunków roślin o od- miennej odporności na chłód, fasoli (Phaseolus coccineus) i grochu (Pisum sativum), potwierdzają rolę plastoglobul w odpowiedzi na stres abiotyczny. Wskazują także na prawdopodobną pośrednią rolę tych struktur w procesie adaptacyjnym roślin do stresu niskiej temperatury. Dalsza analiza plastoglobul izolowanych z ekotypów i mutantów Arabidopsis thaliana wskazuje na podobieństwo charakteru tych zmian zarówno z mu- tantami A. thaliana wrażliwymi na stres chłodu, jak i tymi o obniżonej zawartości lipidów polarnych podkreślając kluczową rolę lipidów prenylowych i karotenoidów w odpor- ności na chłód. Ponadto, uzyskane wyniki dowodzą aktywnej współpracy plastoglobul z błonami tylakoidów poprzez potencjalną redystrybucję związków lipidowych. Charakterystyka najobficiej występującego lipidowego składnika błon tylakoidów – chlo- rofilu, u mutantów z deficytem tego barwnika i u ekotypów A. thaliana, pozwoliła w ni- niejszej pracy doktorskiej na przedstawienie prawdopodobnych szlaków regulacyjnych odpowiedzialnych za konwersję chlorofilu a do b w warunkach stresu silnego i słabego światła. Regulacja cyklu chlorofilowego i związana z tym zawartość chlorofilu a i b podczas stresu ́swietlnego wpływa na zmiany aranżacyjne kompleksów chlorofilowo- białkowych w błonach tylakoidów i jest jednym z mechanizmów adaptacyjnych ro ślin do zmieniających się warunków środowiska. Analiza czterech mutantów o obniżonej zawartości chlorofilu b, trzech mutantów wraż- liwych na działanie niskiej temperatury (chilling-sensitive) i pięciu mutantów o zmie- nionym składzie lipidowym oraz sześciu ekotypów A. thaliana, podłoża genetycznego badanych mutantów, wykazała różnorodność strukturalną i funkcjonalną aparatu foto- syntetycznego oraz ogromny potencjał adaptacyjny chloroplastów.

Chloroplasts are membrane–bound plastids dedicated to photosynthesis that contain highly specialized and actively interacting lipoprotein compartments: thylakoid mem- branes and plastoglobules. The thylakoid membranes are divided into appressed (grana stacks) and non-appressed regions (stroma thylakoids), which contain distinct pho- tosynthetic complexes and also differ in their distribution and abundance within the photosynthetic membranes. This unique thylakoid network construction favors stabi- lization of the chloroplast structure and, at the same time, via complex protein-lipid interactions, maintains flexibility and ability to adjust to dynamically changing environ- mental conditions. Plastoglobules (PGs) are small (30 nm–5 μm), spherical lipoprotein particles filled with neutral lipids and surrounded by a polar lipid monolayer (PGs lipid shell) that can be directly connected to the thylakoid membrane. Structural proteins and enzymes are anchored in the plastoglobule lipid monolayer. In recent years, studies conducted on plastoglobules’ unique protein-lipid content revealed that they play an active role in various metabolic pathways and serve as reservoirs for antioxidant and storage metabolites. Changes in the thylakoid membranes’ fitness caused by an abiotic stress, force alterations in the structure and composition of plastoglobules, which is reflected by visible diversity of their size and number. Unfortunately, the nature of these alterations is still unknown. This thesis focuses on the change of the main lipoprotein chloroplastic compartments: thylakoid membranes and plastoglobules and their po- tential role in response to abiotic stress conditions. It is believed that lipoproteins, as essential components of the complex internal membrane system, play a key role in such response. The main goal of my PhD thesis was to search, characterize and distinguish components of protein or lipid nature involved in the plant stress-resistance mechanism focusing on the low-temperature and light stress, and on possible mechanisms responsible for plant adaptation. To reach this goal several physiological and biochemical analyses were applied: functional analysis of the thylakoid membranes (77 K fluorescence and photo- synthetic activity measurements using Dual-PAM), protein (Native-PAGE electrophoresis, Western-blot), and lipid composition analysis (high-performance liquid chromatography – HPLC) of thylakoids and plastoglobules, analysis of membrane physical properties (membrane fluidity) with protein-protein, lipid-lipid and protein-lipid interactions me- asured by infrared spectroscopy (fourier transform infrared spectroscopy – FTIR) for both structures, together with spatial organization and size measurements of plastoglobules using available microscopic techniques (confocal laser scanning microscopy – CLSM, transmission electron microscopy – TEM, atomic force microscopy – AFM) including elasticity measurements as one of the physical factors defining the shape and size of the objects. The obtained results are presented in the form of three original research papers and a manuscript prepared for publication which are the main parts of individual chapters of my PhD thesis. Detailed characterization of plastoglobules isolated from two plant species with different responses to the chilling stress, bean (Phaseolus coccineus) and pea (Pisum sativum) in control and low-temperature conditions allowed to distinguish the structural and composition changes between these structures confirming their active role in the abiotic stress response. Moreover, the obtained results suggest an indirect participation of plastoglobules in plant adaptation to the low-temperature stress. Further analysis of plastoglobules isolated from Arabidopsis thaliana mutants and corresponding ecotypes indicated that the previously determined nature of plastoglobule alterations correlate with the results obtained for the Arabidopsis mutants with distorted polar lipid content and sensitive to the chilling stress (chilling-sensitive). The crucial role of plastoglobules’ lipid constituents such as prenyl lipids and carotenoids in chilling resistance was shown. Evidence of cooperation between plastoglobules and thylakoids was also determined. The adjustment strategies of the thylakoid membranes to light stress were studied fo- cusing on chlorophyll, the most abundant chloroplast membrane lipid. The analysis performed on the Arabidopsis thaliana chlorophyll b-deficient mutants and ecotypes elucidated possible ways of regulation of the chlorophyll a to b conversion in light stress of different intensities. The adjustment of the total chlorophyll pool, chlorophyll a and b (Chl a and Chl b) content, in thylakoid membranes and also transition of Chl a to b are believed to play significant roles in plant adaptation to changing environmental conditions. The comprehensive analysis, presented in this thesis, via physiological and biochemical approach of four Arabidopsis thaliana mutants deficient in Chl b, three mutants sensitive to low–temperature conditions, five mutants with an altered lipid composition, as well as six Arabidopsis thaliana accessions – the genetic background lines, showcased the diversity of the photosynthetic apparatus’ arrangement and the true adaptive potential of chloroplasts.