Spatiotemporal Light Manipulation for Nonlinear Microscopy

Niniejsza praca prowadzi czytelnika przez współczesną optyczną mikroskopię nieliniową. Najpierw przedstawia ogólne wyzwania w mikroskopii oraz zarysowuje istotne osiągnięcia w dziedzinach mikroskopii nadrozdzielczej i obrazowania przez ośrodki rozpraszające. Następnie prezentuje powszechnie stosowaną skaningową mikroskopię dwu-fotonową, wraz z opisem mikroskopu zbudowanego na bazie projektu Benjamina Judkewitza. Mikroskop umożliwia skanowanie z szybkością 30 klatek na sekundę, oraz pozwala na skanowanie wiązką Bessela czy zastosowanie techniki Image Scanning Microscopy. Mikroskop został wykorzystany w eksperymentach biologicznych do obrazowania in-vivo neuronów wrażliwych na dopaminę. W dalszej części opisano układ do trójwymiarowej nadrozdzielczej mikroskopii wykorzystującej fluktuacje intensywności fluorescencji (SOFI). Do wzbudzenia wykorzystano ogniskowanie czasowe zapewniające oświetlenie szerokim polem (pole widzenia ok. 5050μm2) ograniczone w wymiarze wzdłuż osi optycznej obiektywu do ~2,4μm. Ograniczenie osiowe poprawiono do ~1,2μm korzystając ze wzbudzenia linią i skanowania w jednym wymiarze. Po połączeniu z techniką SOFI uzyskano ~420nm rozdzielczości osiowej, co umożliwia wiarygodne rekonstrukcje w trójwymiarze przy ograniczonym wybielaniu poza płaszczyzną obrazowania. W kolejnej częsci opisano nieliniowe obrazowanie ze wzbudzaniem światłem rozproszonym (NISE). Jest to nowa technika zapewniająca obrazowanie nadrozdzielcze przez ośrodki silnie rozpraszające. Wykorzystanie cząstek lawinowych pozwoliło osiągnąć rozdzielczość 560nm – ponad dwukrotnie lepszą niż teoretyczny limit 1,2μm – w warunkach, w których żadna standardowa metoda nie umożliwia obrazowania. Tak zaskakujący rezultat był możliwy dzięki zrozumieniu i wykorzystaniu statystyki intensywności i efektu pamięci dla światła rozproszonego, oraz wysoko nieliniowej odpowiedzi luminescencyjnej. Wzbudzenie wysoko nieliniowych luminoforów przez światło rozproszone, oraz odpowiednie skanowanie prowadzi do nieinwazyjnego i nadrozdzielczego obrazowania obiektów całkowicie ukrytych za mocno rozpraszającymi, nieprzezroczystymi warstwami. Rozwijana dalej technika NISE może mieć znaczący wpływ zarówno na badania podstawowe, jak i stosowane: od obrazowania biomedycznego i funkcjonalnego (np. badania struktury i aktywności mózgu in-vivo), przez optogenetykę, inteligentne dostarczanie leków za pomocą światła (zlokalizowane uwalnianie związków głęboko w tkankach), terapię fotodynamiczną, obliczenia analogowe za pomocą światła, aż po obróbkę materiałów (gdzie wysokie nieliniowości występują naturalnie). W całej pracy nacisk został położony na odtwarzalność eksperymentów, dostarczając praktycznych instrukcji budowy i użytkowania poszczególnych układów eksperymentalnych. Łącznie wyniki te pokazują, że nieliniowość otwiera ścieżki do głębszego i nadrozdzielczego obrazowania, a co ważniejsze – stanowi znakomite środowisko dla nowych, ciekawych pomysłów w mikroskopii, które po zastosowaniu mogą mieć duży wpływ na świat w którym żyjemy.

This thesis guides through contemporary nonlinear optical microscopy. First, it introduces hurdles in microscopy and outlines the relevant works in the fields of super-resolution microscopy and imaging through scattering media. Then it presents the gold-standard technique of two-photon scanning microscopy and a homemade microscope based on Benjamin Judkewitz's design. The microscope can scan at 30 frames per second, and its flexible design supports additional modalities, such as Bessel-beam or two-photon ISM scanning. The microscope was used for end-user experiments for in vivo calcium imaging of dopamine-sensitive neurons.

Next, I describe another custom setup for 3D super-resolution optical fluctuation imaging with temporal focusing, introducing the key concepts of each method. The setup provides axial sectioning of ~2.4μm (temporal focusing excitation), improved to ~1.2μm in a temporal focusing line-scan variant. When combined with super-resolution optical fluctuation imaging, it delivers ~420nm of axial sectioning, enabling reliable volumetric reconstructions with reduced out-of-focus bleaching.

The central part of the thesis is a detailed description of Nonlinear Imaging with Speckle Excitation (NISE). The novel technique provides super-resolution through highly scattering media. The use of avalanching particles enables achieving a resolution of ~560nm, which is more than 2 times better than the 1.2μm theoretical limit in environments where no standard method can provide imaging. Such a result is possible due to uniting two fundamental properties of scattered light: speckle statistics and the angular memory effect, with a highly nonlinear optical response. This combination yields, rather surprisingly, super-resolution, low-background, non-invasive imaging of objects completely hidden behind a strongly scattering, opaque layer. Further developed NISE has a potential impact across fundamental and applied research: from bio-medical imaging and sensing (in vivo brain structure and activity studies) to optogenetics, smart drug delivery (targeted optical uncaging of drugs deep inside tissues), photodynamic therapy, optical computing, and material processing (where high nonlinearities occur naturally).

Throughout, the thesis emphasises reproducible, custom designs and provides practical build guides and instructions for using the specific experimental setups. Collectively, these results show that nonlinearity offers viable routes to deeper, higher-resolution imaging. More importantly, nonlinear microscopy is a perfect playground for interesting ideas, with significant implications when applied.