Interactions of aminoglycoside antibiotics with ribosomal RNA and riboswitches

Aminoglikozydy należą do znanej klasy antybiotyków, powszechnie stosowanych przeciwko poważnym infekcjom, wywołanym przez bakterie Gram-ujemne. Ze względu na rosnącą antybiotykooporność u wielu bakterii, istnieje pilna potrzeba wprowadzenia nowych modyfikacji istniejących aminoglikozydów oraz poszukiwania nowych inhibitorów translacji bakteryjnej. W celu zaproponowania nowych środków przeciwbakteryjnych, niezbędne jest dokładne zbadanie interakcji pomiędzy aminoglikozydami i ich celami molekularnymi. W niniejszej pracy doktorskiej przedstawiono wyniki badań nad trzema strukturami RNA, do których wiążą się aminoglikozydy: regionem dekodującym i wiązania tRNA (tzw. miejscem A), Helisą 69 oraz ryboprzełącznikiem N1. Dwie struktury występują naturalnie w rybosomach bakteryjnych, trzecia jest natomiast syntetycznym konstruktem. Głównym miejscem wiązania aminoglikozydów u bakterii jest miejsce A, znajdujące się w małej podjednostce rybosomu bakteryjnego. Odgrywa ono istotną rolę w procesie dekodowania, czyli odczytywania informacji, zawartej w matrycowym RNA, oraz przyłączania odpowiednich transferowych RNA, które niosą aminokwasy. W obecności aminoglikozydów, związanych w miejscu A, następuje zakłócenie tego procesu, przez co do tworzonego białka mogą zostać włączone niewłaściwe aminokwasy. Tak powstałe białka są często dysfunkcyjne, co powoduje śmierć komórki bakteryjnej. W przedstawionej pracy została przeprowadzona szczegółowa analiza oddziaływań elektrostatycznych, które są głównym motorem w procesie przyłączania aminoglikozydów do miejsca A. W tym celu wykorzystano nowoczesne techniki obliczeniowe, które biorą pod uwagę asferyczność gęstości elektronowej. Wyodrębnione zostały grupy funkcyjne aminoglikozydów, które pełnią szczególnie ważną rolę w wiązaniu aminoglikozydów do miejsca A. Dzięki analizie motywów wiązań wodorowych pomiędzy RNA a antybiotykami, zaproponowano modyfikacje antybiotyków w celu uzyskania lepszego powinowactwa do receptora. Helisa 69 jest fragmentem mostka, łączącego małą i dużą podjednostkę rybosomu. Przyłączenie aminoglikozydów w tym miejscu powoduje zakłócenia w asocjacji podjednostek rybosomu. Jest to zatem doskonały cel do wiązania nowych środków antybakteryjnych, zaprojektowanych z wykorzystaniem technik antysensownych, polegających na komplementarnym wiązaniu oligomerów wybranego kwasu nukleinowego, na przykład peptydowego kwasu nukleinowego, do receptora. W pracy doktorskiej zostały eksperymentalnie zbadane oddziaływania Helisy 69 zarówno z aminoglikozydem neomycyną, jak i z nowozaprojektowanym związkiem. Eksperymenty obejmowały między innymi analizę krzywych topnienia kompleksów, dichroizm kołowy i pomiary kalorymetryczne. W celu upewnienia się, że nowy związek nie jest toksyczny dla ludzi, zbadane zostały nie tylko oddziaływania z bakteryjnym RNA, ale także z odpowiednikiem Helisy 69 u człowieka. Wyniki badań pokazują, że nowy związek, połączony kowalencyjnie z peptydem wspomagającym wnikanie do komórki bakteryjnej, wiąże się specyficznie z Helisą 69 i jest w stanie zablokować translację bakteryjną. Ostatnią zbadaną strukturą RNA jest mały, syntetyczny ryboprzełącznik N1. Za pomocą przyłączania różnych aminoglikozydów do tego fragmentu RNA, można kontrolować ekspresję wybranego genu, na przykład u drożdży. Przy braku obecności aminoglikozydów, drożdże wytwarzają fluorescencyjne białko, którego ilość jest mierzona w eksperymencie. Aminoglikozydy neomycyna oraz rybostamycyna powodują zatrzymanie produkcji tego białka reporterowego. Paromomycyna, którą różni się od neomycyny tylko jedną grupą funkcyjną, wiąże się do ryboprzełącznika, ale nie ma wpływu na ekspresję genu kodującego białko i jest ono dalej wytwarzane. W niniejszej pracy, struktura tego ryboprzełącznika bez ligandów oraz w kompleksach z wymienionymi aminoglikozydami, została zbadana za pomocą symulacji dynamiki molekularnej z wymianą replik. Znalezione zostały subtelne różnice w sieciach wiązań wodorowych, które decydują o odmiennej dynamice badanych układów, widocznej, między innymi, w postaci zasad o podwyższonej mobilności. Związanie ryboprzełącznika z paromomycyną okazało się usztywniać sąsiednie nukleotydy. Jednocześnie najnowsze badania eksperymentalne sugerują, że kompleks z paromomycyną wykazuje podwyższoną mobilność względem innych kompleksów. Badania nad ryboprzełącznikiem są obecnie kontynuowane w celu rozwikłania tego zagadnienia. Podsumowując, w niniejszej pracy zostały szczegółowo zbadane oddziaływania pomiędzy antybiotykami aminoglikozydowymi a ich miejscami wiązania. Zaprojektowano nowe modyfikacje aminoglikozydów. Pokazano, że miejsca wiązań aminoglikozydów mogą zostać z sukcesem wykorzystane jako cel dla nowych związków, blokujących translację u bakterii. Podjęto także próbę wyjaśnienia mechanizmu decydującego o aktywności ryboprzełącznika z różnymi aminoglikozydami. Przedstawiona praca doktorska znacznie poszerza wiedzę na temat oddziaływań pomiędzy aminoglikozydami a RNA, co stanowi podstawę do projektowania nowych antybiotyków i może przyczynić się do skuteczniejszej walki z opornością bakteryjną.

Aminoglycosides are a well-known class of antibiotics, commonly used against serious Gram-negative bacterial infections. Due to rapidly emerging bacterial resistance, a burning need to find new inhibitors of bacterial translation or to modify existing antibiotics has appeared. Thus, an insight and careful investigation of their interactions with RNA is necessary. This PhD thesis presents the results of studies on three aminoglycoside-binding RNA structures: A-site, Helix 69 and N1 riboswitch. Two of them occur naturally in bacterial ribosomes and the latter one is a synthetic construct. The main aminoglycoside binding site in bacteria, A-site, is located in the small ribosomal subunit. It plays a major role in the decoding process, in which the information from messenger RNA is analyzed and a correct transfer RNA, carrying amino acids, is incorporated. An aminoglycoside bound in the A-site in helix 44 impedes this process. As a result, the newly created protein may contain inappropriate amino acids and be dysfunctional which leads to the death of a whole bacterial cell. Presented work shows a detailed analysis of electrostatic interactions as it is a main driving force in aminoglycoside-RNA binding. Modern computational techniques, taking into account the asphericity of the electron density, were applied. Several functional groups of aminoglycosides were found to be crucial for binding. Analysis of the patterns of water molecules mediating hydrogen bonds between RNA and antibiotics allowed to propose new modifications of aminoglycosides, enhancing drug binding properties. Helix 69 is a part of the bridge joining small and large subunits of the ribosome. Aminoglycosides attached at this site interfere with the association process of the ribosomal subunits. Therefore, it is a perfect target to bind new antibacterial agents designed using antisense techniques, based on the complementary binding of a chosen nucleic acid oligomer, for example of a peptide nucleic acid oligomer, to the receptor. As part of this work, an experimental investigation of interactions of Helix 69 with an aminoglycoside neomycin and also with the newly designed compound has been conducted. The experimental techniques included melting curves analysis, circular dichroism, and calorimetry. To ensure that the designed compound is not toxic for people, an analysis of interactions with human Helix 69 was also performed. The results of the study indicate that the new compound conjugated with a cell penetrating peptide, enabling the cellular uptake by bacteria, binds specifically to Helix 69 and is able to inhibit bacterial translation. The last investigated RNA structure is a small, synthetic riboswitch N1. By binding different aminoglycosides, it is possible to control the expression of a chosen gene, for example in yeast. When no aminoglycoside is present, the fluorescence protein, measured in the experiment, is produced. Aminoglycosides neomycin and ribostamycin inhibit the expression of the gene coding the reporter protein. Paromomycin, which is identical with neomycin except for one functional group, binds to the riboswitch but does not affect the expression of the protein coding gene. Thus, the protein is still produced. In the present study, the structure of the N1 riboswitch in a free state and in complexes with aminoglycosides was investigated using replica exchange molecular dynamics simulations. A few subtle differences between the hydrogen bond networks of studied systems were revealed. These differences alter the mobility of the neighboring bases. The riboswitch bound with paromomycin was found to be much more stiff in comparison with other complexes. On the other hand, recent experimental reports suggest that the presence of paromomycin in the complex results in increased mobility of the bases. Currently, the studies on the riboswitch complexes are continued to explain these effects and to obtain a complete insight into the riboswitch mode of action. To conclude, the presented PhD dissertation shows a detailed image of the interactions of aminoglycoside antibiotics with their binding sites. New modifications of aminoglycosides have been designed. It was shown, that aminoglycoside binding sites can be successfully used as targets for new compounds, able to inhibit bacterial translation. An attempt to explain the mechanism deciding about the activity of riboswitch with different aminoglycosides was made. This dissertation significantly broadens the knowledge in the field of interactions between aminoglycosides and their binding targets and can contribute to circumventing bacterial resistance in a more efficient way.