Biokoniugaty o potencjalnej aktywności antyangiogennej

Choroby nowotworowe są aktualnie jedną z głównych przyczyn zgonów na świecie. Jednym z kluczowych procesów rozwoju nowotworów jest angiogeneza. Jest to proces tworzenia nowych naczyń włosowatych z już istniejących naczyń krwionośnych, który umożliwia dostarczenie tlenu i składników odżywczych do komórek nowotworowych. Spośród różnych czynników proangiogennych najbardziej istotnym jest czynnik śródbłonka naczyń VEGF-A, którego główna forma VEGF165 wiąże się z wysokim powinowactwem do receptorów kinaz tyrozynowych VEGFRs na powierzchni komórek śródbłonka. Utworzenie kompleksu VEGF165/VEGFR jest etapem, który wywołuje proliferację komórek, migrację i rozprzestrzenianie naczyń krwionośnych. To wiązanie ligandu do receptora może być znacznie zwiększone przez oddziaływanie VEGFR z koreceptorem neuropiliną-1 (NRP-1). NRP-1 jest transbłonową glikoproteiną, która także występuje w nadekspresji na powierzchni błon komórkowych różnych typów nowotworów, sugerując jej rolę w zwiększonej progresji naczyń krwionośnych oraz agresywności nowotworu i złego rokowania Zahamowanie angiogenezy stanowi obecnie jeden z ważnych kierunków poszukiwań nowych leków w terapiach przeciwnowotworowych. Przedstawiona praca doktorska prezentuje syntezę dwóch rodzajów koniugatów o potencjalnej aktywności antyangiogennej, zaprojektowanych tak aby selektywnie oddziaływały z NRP-1. Pierwsza grupa obejmuje koniugaty peptydu lub peptydomimetyku z nanocząstkami magnetycznymi, a druga koniugaty peptydu A7R z lekiem przeciwnowotworowym-5-flurouracylem (5-FU). W przypadku koniugatów z nanocząstkami magnetycznymi w pierwszej kolejności dobrano warunki reakcji przyłączania do nanocząstek heptapeptydu A7R (H-Ala-Thr-Trp-Leu-Pro-Pro-Arg-OH), którego antyangiogenne i przeciwnowotworowe właściwości zostały udowodnione przez grupę profesora Perreta z Uniwersytetu Paris 13. Do syntezy koniugatów wykorzystano nanocząstki magnetyczne zbudowane z ferrytu niklowo-cynkowego, których powierzchnia została zmodyfikowana kwasem sebacynowym. Największym wyzwaniem w tej części pracy był dobór odpowiednich warunków reakcji oraz odpowiednich metod fizykochemicznych do scharakteryzowania otrzymanego koniugatu. Finalnie peptyd A7R został przyłączony do nanocząstek magnetycznych za pomocą wiązania amidowego a do potwierdzenia skutecznej koniugacji wykorzystano m.in. takie metody jak spektroskopia w podczerwieni, termograwimetria, transmisyjna mikroskopia elektronowa. Wstępne badania cytotoksyczności otrzymanego koniugatu na dwóch liniach komórkowych nowotworowej i normalnej z ekspresją NRP-1 wykazały, że nanocząstki zmodyfikowane peptydem A7R wykazują działanie cytotoksyczne (zarówno na komórki nowotworowe jak i normalne), w przeciwieństwie do samego peptydu A7R i nanocząstek zmodyfikowanych kwasem sebacynowym. W kolejnej części praca ukazuje badania nad sposobem połączenia z nanocząstkami magnetycznymi peptydomimetyku H-Lys(hArg)-Dab-Pro-Arg-OH opracowanym w Pracowni Peptydów, wykazującym lepszą zdolność inhibicji układu VEGF165/NRP-1. W związku z tym, że peptydomimetyk posiada aż trzy grupy aminowe w cząsteczce, do których potencjalnie można przyłączyć nanocząstek uprzednio został sfunkcjonalizowany o kwas pent-4-ynowy. Następnie peptydomimetyk został przyłączony za pomocą pierścienia triazolowego do nanocząstek magnetycznych, których kwas sebacynowy został dodatkowo związany z cząsteczką H2N-PEG(3)-N3. Ostatnia cześć pracy przedstawia syntezę dwóch koniugatów 5-fluorouracylu z peptydem A7R, różniących się linkerem pomiędzy A7R a lekiem przeciwnowotworowym. W pierwszym koniugacie 5-FU był połączony z peptydem A7R za pomocą kwasu octowego, a w drugim za pomocą kwasu bursztynowego, co zapewniło połączenie obu cząsteczek odpowiednio za pomocą wiązania amidowego i estrowego. Celem otrzymania tego typu koniugatów było sprawdzenie czy połączenie 5-FU z peptydem A7R wpłynie na zmniejszenie toksyczności 5-FU względem normalnych komórek. Przeprowadzone badania in vitro na normalnej i nowotworowej linii komórkowej wykazały, że koniugat z wykorzystaniem jako łącznika kwasu octowego nie wykazuje działania cytotoksycznego wobec obu linii komórkowych. Natomiast koniugat z wykorzystaniem jako linkera kwasu bursztynowego okazał się znacznie bardziej toksyczny niż sam 5-fluorouracyl.

Cancer is one of the major health concerns worldwide. One of the processes, which play a crucial role in solid tumor growth, is angiogenesis. In this process, new capillaries are generated from pre-existing blood vessels, which allow the delivery of oxygen and nutrients for tumor cells and facilitate tumor progression, invasion, and metastasis. Therefore, antiangiogenic therapy is one of the promising approaches for cancer treatment. Among various proangiogenic factors, the most essential and characterized is vascular endothelial growth factor A (VEGF A). The VEGFA’s predominant isoform is VEGF165, which binds with high affinity to tyrosine kinase domain receptors (VEGFRs) on the surface of endothelial cells. VEGF165/VEGFR complex formation is a critical step, which induces the major proangiogenic activities of VEGF, including cell proliferation, migration, and capillary sprouting. This ligand-receptor binding can be significantly enhanced by association of VEGFR with the co-receptor neuropilin-1 (NRP-1). One of the promising peptides with antiangiogenic activity is a heptapeptide ATWLPPR (A7R) which binds specifically to NRP-1 and selectively inhibits VEGF165 binding to this receptor. In vitro and in vivo studies have shown that A7R inhibits tumor growth and angiogenesis in a breast cancer cell xenograft in nude mice. Laboratory of Peptides at University of Warsaw has synthesized peptide analogue: H-Lys(hArg)-Dab-Pro-Arg-OH, which is much more active in inhibiting binding of VEGF165 to NRP-1 than A7R peptide. The main goal of this Ph.D. dissertation was synthesis of conjugates with potential anti angiogenic activity, which can selectively interact with NRP-1 receptor, which is involved in the regulation of angiogenesis. In the first part of this Ph.D. dissertation peptidomimetics H-Lys(hArg)-Dab-Pro-Arg-OH was modified by different functional groups before attachment to nanoparticles. The peptidomimetic has three amine groups so it can’t be attach to nanoparticle by amide bond. Therefore, the peptidomimetic was modified by introducing cysteine, 6-maleimidohexanoic acid or pent-4-ynoic acid which allows further attachment of peptidomimetic to nanoparticles via disulfide bond, thioether bond or triazole ring, respectively. Among all obtained peptidomimetic analogues, peptidomimetics with introduced pent-4-ynoic acid was tested by ELISA. The obtained results indicated that the appropriate sequence possible to attach to magnetic nanoparticles without loss of biological activity is H-Lys (pent-4-ynoicα-hArg)-Dab-Pro-Arg-OH. In the second part of Ph.D. dissertation peptide A7R or peptidomimetic is dansyl-Lys (pent-4-ynoicα-hArg)-Dab-Pro-Arg-OH (the dansyl group was introduced to spectrophotometric monitoring whether the unreacted peptidomimetic was removed after the reaction) were conjugated to magnetic nanoparticles modified with sebacic acid. Peptide A7R was conjugated to nanoparticles via the amide bond. Successful conjugation was confirmed by various analytical techniques. Cell cytotoxicity studies, against two cell lines indicated that magnetic nanoparticles modified with A7R reduced cell viability at concentrations higher than 0,01 mg Fe/mL, in comparison to cells that were exposed to either the nanoparticles modified with sebacic acid or A7R peptide solely. Then peptidomimetic dansyl-Lys (pent-4-ynoicα-hArg)-Dab-Pro-Arg-OH was conjugated to nanoparticles. However, nanoparticles have been modified with linker with carboxyl groups. Therefore, before attachment of peptidomimetic to nanoparticles modification of nanoparticles was needed to gain azide groups on nanoparticles. Nanoparticles were modified with amine-PEG-azide and then peptidomimetic was conjugated to nanoparticles using click chemistry. The last goal of this Ph.D. dissertation was synthesis of conjugates of peptide A7R with an anticancer agent-5-fluorouracil. At first, 5-fluorouracil was modified at N-1 with succinate or acetamide linkers, respectively. Next, obtained 5-fluorouracil derivatives were attached to A7R peptide via the amide bond to N-terminal amine group of alanine. Cell cytotoxicity studies, against two cell lines indicated that A7R-5-fluorouracil conjugate with acetamide linker exhibited no cytotoxicity against any of the two cell lines. However, A7R-5-fluorouracil conjugate with succinate linker showed much greater cytotoxicity than 5-fluorouracil solely.