Rola czynników transkrypcyjnych Smad w cyklicznej regulacji komórek macierzystych mieszka włosowego

W dorosłym organizmie komórki macierzyste (SCs, ang. Stem Cells) odpowiadają za naprawę uszkodzonych tkanek oraz utrzymanie całego organizmu w stanie równowagi. W mieszku włosowym (HF, ang. Hair Follicle), w miejscu zwanym wybrzuszeniem, znajduje się pula komórek macierzystych mieszka włosowego (hfSCs, ang. hair follicle Stem Cells), które odpowiadają za regenerację włosa. Komórki te są łatwo dostępnym źródłem SCs, charakteryzują się cykliczną regeneracją i stanowią doskonały model do badania ich biologii. HF ulega cyklicznym fazom wzrostu, regresji i spoczynku, a procesy te są kontrolowane przez utrzymanie równowagi pomiędzy czynnikami hamującymi i aktywującymi, których identyfikacja jest istotnym zagadnieniem w medycynie regeneracyjnej. Badania przeprowadzone w naszym laboratorium wykazały, że stała konkurencja między szlakami sygnałowymi BMP (ang. Bone Morphogenetic Protein) oraz WNT (ang. Wingless-type MMTV integration site family) jest niezbędna do utrzymania hfSCs w stanie równowagi biologicznej. Ponadto, wyniki tych badań podkreślają krytyczną rolę szlaku BMP w utrzymaniu hfSCs w fazie spoczynkowej. Czynniki transkrypcyjne Smad 1/5/9 są głównymi przekaźnikami sygnału w kanonicznej ścieżce sygnałowej BMP. Nasze poprzednie badania wykazały różnorodną rolę fosforylowanych czynników transkrypcyjnych Smad w morfogenezie włosów i skóry jak i w regulacji cyklu postnatalnego włosów. Dotąd nie wyjaśniono jednak w jaki sposób poszczególne białka Smad 1, 5, 9 (Smads) docelowo aktywowane przez kanoniczną ścieżkę BMP uczestniczą w cyklicznej regulacji komórek macierzystych włosa. W badaniach, prowadzonych w ramach mojego projektu doktoranckiego, wykorzystywane zostały innowacyjne i unikalne narzędzia inżynierii genetycznej w modelu zwierzęcym. Do zbadania funkcji czynników transkrypcyjnych Smad in vivo wykorzystaliśmy myszy modyfikowane genetycznie z indukowalną, tkankowo-specyficzną delecją genów Smad1, Smad5 lub obu jednocześnie. Dodatkowo zastosowany został unikalny system Tet-ON, który pozwolił na indukcję konstytutywnie aktywnej formy receptora Bmpr1a, który fosforyluje białka Smad 1/5/9. W celu identyfikacji genów regulowanych przez fosforylowane czynniki transkrypcyjne Smad i ich interakcji z chromatyną wykorzystana została technika immunoprecypitacji chromatyny oraz sekwencjonowania nowej generacji (ChIP-seq). Otrzymane wyniki pozwoliły na szersze zrozumienie w jaki sposób cykl regeneracji włosa jest regulowany na poziomie molekularnym. Dane wskazują na kluczową rolę czynników transkrypcyjnych Smad 1/5/9 w utrzymaniu komórek macierzystych mieszka włosowego w stanie spoczynku regulując aktywność wielu genów sygnaturowych hfSCs. Wyniki powyższych badań podkreślają nadrzędną rolę ścieżki BMP, a w szczególności dominujący udział fosforylowanego czynnika transkrypcyjnego Smad1 w utrzymaniu hfSCs w stanie spoczynku. Ponadto wykazano także ich bezpośrednią funkcję regulacyjną na ścieżki sygnałowe WNT i BMP. Spośród poprzednio odkrytych genów osiowych wewnętrznego oscylatora, zidentyfikowano 61% genów bezpośrednio regulowanych przez pSmads w hfSCs. Porównanie sekwencji motywów dla Smad1 i Smad5 pozwoliły na uściślenie ich sekwencji i odnalezienie ich motywów wiązania w 82% wszystkich pików. W ponad połowie (52,55%) wszystkich pików, znaleźliśmy sekwencje odpowiadające jedynie motywom wiążącym pSmad1. Wśród prawie 22% pików znajdowały się motywy wiązania zarówno dla pSmad1 jak i pSmad5, a wśród 7,7% motywy jedynie dla pSmad5. Natomiast wśród pozostałych pików stanowiących niespełna 18%, w których nie znaleziono motywów wiązania dla Smad1 i Smad5, poszukiwaliśmy sekwencji dla dotąd niezidentyfikowanego motywu dla Smad9. Zaskoczeniem było odkrycie, że 75% tych pików posiada motywy wiązania dla czynników transkrypcyjnych NFIA i LHX2. Analiza odległości występowania motywów dla Smad1, Smad5 oraz Smad4 w odkrytych pikach wykazała, że znajdują się one w bliskim sąsiedztwie względem siebie w miejscach regulatorowych genów w hfSCs.

In the adult body, Stem Cells (SCs) are responsible for repairing damaged tissues and maintaining the organism in balance. In the hair follicle (HF), in a place called a bulge, there is a population of hair follicle Stem Cells (hfSCs), which are responsible for hair regeneration. These cells are an easily available source of SCs characterized by cyclic regeneration, providing an excellent model for studying their biology. HF undergoes cyclic phases of growth, regression and rest, and these processes are controlled by maintaining a balance between various inhibitory and activating factors, the identification of which is an important issue in regenerative medicine. Our studies have shown that constant competition between the Bone Morphogenetic Protein (BMP) and Wingless-type MMTV integration site family (WNT) signaling pathways is essential for maintaining hfSCs in a state of biological equilibrium. In addition, these studies highlight the critical role of the BMP pathway in maintaining hfSCs in the quiescent phase. Smad 1/5/9 transcription factors are major signal transducers in the canonical BMP signaling pathway. Our previous studies have demonstrated a distinct role for phosphorylated Smad transcription factors in hair and skin morphogenesis as well as in regulation of the postnatal hair cycle. However, how Smad proteins 1/5/9 (Smads) participate in the cyclic regulation of hair follicle Stem Cells have not been elucidated so far In my Ph.D. project, I used innovative and unique genetic engineering tools in animal models. To study the function of Smad transcription factors in vivo, genetically modified mice with inducible, tissue-specific deletion of Smad1, Smad5 or both genes simultaneously were used. In addition, a Tet-ON system was used to induce a constitutively active form of the Bmpr1a receptor, which phosphorylates Smad 1/5/9 proteins. Finally, chromatin immunoprecipitation and subsequent Next Generation Sequencing (ChIP-seq) techniques were used to identify genes regulated by Smad transcription factors and their interaction with chromatin. The results provided a broader understanding of how the hair regeneration cycle is regulated at the molecular level. The data indicate a key role for Smad 1/5/9 transcription factors in keeping stem cells in quiescence by regulating the activity of many hfSCs signature genes. These studies underscore the superior role of the BMP pathway, especially the dominant participation of phosphorylated Smad1 transcription factor, in maintaining hfSCs in homeostasis, especially by binding to multiple cis-regulatory regions of quiescent hfSCs signature genes. Moreover, the direct regulatory function of pSmads on the WNT and BMP signaling pathways has been demonstrated. Among the previously discovered internal oscillator axial genes, we identified 61% of those genes directly regulated by pSmads in hfSCs. Sequence comparison of motifs for Smad1 and Smad5 in all our peaks allowed to refine their sequences relative to those found in databases. Binding motifs characteristic for Smad1 and Smad5 were found in 82% of all peaks for pSmad 1/5/9. In more than half (52.55%) of all Smad 1/5/9 peaks, we found sequences corresponding to only pSmad1 binding motifs. Nearly 22% of the peaks had binding motifs for both pSmad1 and pSmad5, and 7,7% contained motifs for pSmad5 only. On the other hand, among the remaining peaks, constituting less than 18%, in which no binding motifs for Smad1 and Smad5 were found, we searched for a sequence for a hitherto unidentified motif for Smad9. It was surprising to find that 75% of these peaks have binding motifs for the transcription factors NFIA and LHX2.Futhermore, the distance analysis of the motifs for Smad1, Smad5 and Smad4 in the discovered peaks showed that they are in close proximity to each other in the regulatory sites of genes in hfSCs.