Układy woltamperometryczne i grawimetryczne do detekcji metaloproteinaz macierzy -1, -2 i -9 w ludzkim raku płuca

Bez wątpienia postępy we współczesnej diagnostyce medycznej umożliwiły znaczną poprawę jakości życia chorych ze zdiagnozowaną na wczesnym etapie chorobą nowotworową oraz wydłużenie ich średniej długości życia. Szacuje się, że w 2030 r. co drugi mężczyzna i co trzecia kobieta w swoim życiu zachoruje na raka. Zgodnie z zasadą, że „lepiej zapobiegać niż leczyć”, coraz więcej uwagi poświęca się poszukiwaniu nowych i udoskonalaniu obecnych już narzędzi i procedur diagnostycznych. Podstawę analizy diagnostycznej stanowi charakterystyka ilościowa biomarkerów. Poszukiwane są nie tylko nowe markery stanów patologicznych, ale także skuteczniejsze i dokładniejsze metody ich oznaczania, pozwalające na wykrywanie subtelnych zmian chorobowych w organizmie. Zapotrzebowanie na bioczujniki rośnie ze względu na ich różnorodne zastosowania medyczne, jako małych i szybkich w działaniu urządzeń diagnostycznych dających jednoznaczny wynik. Opracowanie lepszych testów diagnostycznych ukierunkowanych na detekcję biomarkerów zapewnia niespotykany dotąd wachlarz możliwości: (i) wskazanie ryzyka wystąpienia danej choroby, (ii) diagnozę we wczesnym stadium choroby, (iii) wskazanie właściwej ścieżki procesu terapeutycznego, oraz (iv) monitorowanie postępów zastosowanych metod terapeutycznych. Ważną grupą biomarkerów są markery nowotworowe, czyli substancje wskazujące na możliwy przebieg onkogenezy i rozwój choroby nowotworowej. Niestety większość z nich nie wykazuje swoistości wobec tylko jednego typu nowotworu. Dlatego wciąż poszukuje się nowych i bardziej swoistych biomarkerów. Dobrym kandydatem są metaloproteinazy, których poziom w organizmie ulega zmianie na skutek długotrwałej dysregulacji poziomu i aktywności metaloproteinaz macierzy pozakomórkowej w sytuacji pojawienia się choroby nowotworowej. Niniejsza rozprawa doktorska dotyczy procedur konstrukcji i charakterystyki analitycznej czujników woltamperometrycznych i grawimetrycznych do detekcji różnych form MMP-1, MMP-2 i MMP-9. Przedstawione w niniejszej rozprawie doktorskiej woltamperometryczne i grawimetrytczne bioczujniki do detekcji MMP są alternatywą w stosunku do konwencjonalnych sposobów ich oznaczania w próbkach klinicznych. W związku z tym, że metaloproteinazy macierzy pozakomórkowej nie są elektroaktywne istniała konieczność wprowadzenia do układu rozpoznającego próbnika redoks, który umożliwił woltamperometryczną detekcję badanych metaloproteinaz. Dlatego wykorzystane w badaniach dwu- lub triaminokwasowe peptydy, charakterystyczne dla aktywności katalitycznej MMP-1, MMP-2 i MMP-9, wyznakowano określonymi próbnikami redoks (MMP-1: Cys-Gly-Ile-MB; MMP-2: 10 Gly-Leu-AQ i MMP-9: Gly-Met-Fc). Synteza poszczególnych receptorów (di- /tripeptyd-próbnik redoks) opierała się na reakcji tworzenia wiązań amidowych pomiędzy poszczególnymi reagentami, a w celu uproszczenia czynności preparatywnych reakcje prowadzono metodą syntezy na fazie stałej. W roli platform umożliwiających stabilne zakotwiczenie zsyntezowanych receptorów (Cys-Gly-Ile-MB; Gly-Leu-AQ i Gly-Met-Fc) na drodze wiązań kowalencyjnych wykorzystano cysteaminę, polietylenoiminę oraz dendrymer PAMAM G2. Etapem wieńczącym cykl badań opisanych w niniejszej dysertacji było skonstruowanie czujnika woltamperometrycznego do jednoczesnej detekcji aktywnych form wszystkich trzech metaloproteinaz: MMP-1, MMP-2 i MMP-9. Aby w sposób odtwarzalny wprowadzić trzy receptory na powierzchnię elektrody zastosowano dendrymer PAMAM zawierający znaną liczbę trzech różnych grup funkcyjnych: –NH2, –COOH i –SH. Funkcjonalność opracowanych czujników sprawdzono wobec szczurzych ekstraktów tkankowych (osocze, guz i płuca). Wyniki przeprowadzonych badań udowodniły, że czułość zaproponowanych czujników do detekcji MMP-1, MMP-2 i MMP-9 jest zdecydowanie wyższa niż komercyjnie dostępnych testów ELISA.