Fluorescencyjne RNA jako sondy molekularne do monitorowania aktywności enzymów degradacji kapu

Enzymatyczna degradacja kapu (ang. decapping, dekaping) – charakterystycznej struktury znajdującej się na końcu 5’ mRNA, zwanej inaczej czapeczką, jest kluczowym procesem komórkowym, mającym na celu regulację poziomu ekspresji genów. Dekaping polegający na hydrolizie wiązania fosforanowego, zlokalizowanego w mostku łączącym strukturę kapu z dalszą sekwencją nukleotydów w RNA, skutkuje wyeksponowaniem 5’-monofosforylowanego RNA na degradację przez egzorybonukleazy. Obecnie w literaturze opisanych jest około 20 enzymów zdolnych do degradacji kapu, jednak ich preferencje substratowe są jedynie zgrubnie oszacowane. Nadal również niepoznane są dokładne mechanizmy aktywacji tych enzymów. Liczne doniesienia literaturowe wskazują na występowanie różnych wariantów kanonicznej struktury kapu m7G w cząsteczkach RNA niekodujących białek. Pełny obraz metabolizmu RNA stanowi podstawę w zrozumieniu dynamiki komórki i tym samym jest fundamentalnym elementem w rozwoju nowych podejść terapeutycznych. Stworzenie odpowiednich narzędzi do wizualizacji przebiegu procesu degradacji RNA in vitro i in vivo wydaje się więc być kluczowe do osiągnięcia tego celu. Badania prowadzone w ramach niniejszej rozprawy doktorskiej dotyczą syntezy oraz charakterystyki sond fluorescencyjnych, opartych na strukturze RNA i zdolnych do selektywnego monitorowania aktywności enzymów degradujących kap. Pierwszy etap moich badań polegał na opracowaniu testu fluorescencyjnego (FLINT, ang. fluorescence intensity, intensywność fluorescencji), który umożliwia wysokoprzepustową analizę specyficzności substratowej enzymów dekapujących. W tym celu przeprowadziłam syntezę siedmiu naturalnych, di- oraz trinukleotydowych analogów kapu, wykorzystując do tego podejście oparte na syntezie chemicznej, łączące chemię fosforu (III) z chemią fosforu (V). Każdy ze związków był poddany dwuetapowemu oczyszczaniu celem zapewnienia jak najwyższej jakości próbki. W kolejnym kroku przygotowane kapy były kotranskrypcyjnie wprowadzane do sekwencji 70-nukleotydowego RNA. Transkrypcja in vitro (IVT) była prowadzona na specjalnie zaprojektowanych do tego celu matrycach DNA, kodujących aptamerową sekwencję Broccoli, wzbogaconą o fragment poliA. Finalnie RNA wraz z dedykowanym mu fluorogenicznym ligandem DFHBI-1T, zostało wykorzystane do przeprowadzenia fluorescencyjnego testu, w wyniku którego ustalono preferencje substratowe siedmiu wybranych enzymów dekapujących, pochodzących z różnych organizmów. W ramach tej części badań przeprowadzono również pomiary kinetyczne z udziałem enzymu hDcp2 oraz kapu-1, które pozwoliły na wyznaczenie parametrów kinetycznych reakcji. Wykazano też przydatność testu FLINT do poszukiwania inhibitorów enzymów dekapujących. Ustalenie zakresu aktywności poszczególnych enzymów posłużyło mi do opracowania dwuznakowanych sond fluorescencyjnych, ukierunkowanych na pojedynczy cel molekularny, co było przedmiotem drugiego etapu moich badań. Syntezę podwójnie znakowanych sond fluorescencyjnych rozpoczęłam od przygotowania trinukleotydowych analogów kapu, zawierających linkery umożliwiające przyłączenie barwnika. W takiej formie analogi struktury kapu były wprowadzane do nici RNA i znakowane odpowiednimi barwnikami. Drugie podejście obejmowało znakowanie trinukleotydów, a dopiero w następnym etapie przeprowadzanie IVT. Niezależnie od przyjętej strategii, wyznakowane i kapowane RNA, były poddawane znakowaniu na końcu 3’ sekwencji, stosując metodę enzymatyczną lub chemiczną. Barwniki zostały dobrane tak, aby tworzyły pary fluorofor-wygaszacz bądź donor-akceptor, umożliwiającą obserwację zjawiska FRET. Sondy fluorescencyjne były poddane charakterystyce metodami biofizycznymi, a te o najkorzystniejszych właściwościach, scharakteryzowane również pod kątem przydatności do monitorowania reakcji enzymatycznych z białkami degradującymi kap. Ma to duże znaczenie w kontekście opracowania nowych podejść terapeutycznych bazujących na cząsteczkach RNA, których trwałość i stabilność jest kluczowa.

Enzymatic degradation (decapping) of the cap - a characteristic structure at the 5' end of mRNA - is a key cellular process for regulating gene expression levels. Decapping, which involves the hydrolysis of a phosphate bond located in the bridge connecting the cap structure to the downstream nucleotide sequence in the RNA, results in the exposure of the 5'-monophosphorylated RNA to degradation by exoribonucleases. To date, approximately 20 enzymes capable of cap degradation have been described in the literature, but their substrate preferences have only been roughly estimated. The exact mechanisms of activation of these enzymes are also unknown. It is known that their recruitment requires a number of accessory proteins and other factors, such as divalent cations, which together facilitate the adoption of the appropriate conformation of the active protein and RNA. In addition, numerous reports in the literature indicate the existence of different variants of the canonical cap structure in non-coding RNA molecules. A complete picture of RNA metabolism forms the basis for understanding cell dynamics and is thus fundamental for the development of new therapeutic approaches. The development of appropriate tools to visualize the course of RNA degradation in vitro and in vivo seems to be crucial to achieve this goal. The research carried out within this thesis concerns the synthesis and characterization of RNA structure-based fluorescent probes capable of selectively monitoring the activity of cap-degrading enzymes. The first phase of my research involved the development of a fluorescence intensity (FLINT) assay that allows high-throughput analysis of the substrate specificity of decapping enzymes. To this end, I synthesized seven natural, di- and trinucleotide analogs of cap using a chemical synthesis approach that combines phosphorus (III) chemistry with phosphorus (V) chemistry. Each compound was subjected to a two-step purification to ensure the highest possible sample quality. In the next step, the prepared cap analogues were cotranscriptionally incorporated into the 70-nucleotide RNA sequence. In vitro transcription (IVT) was performed on custom-designed DNA templates encoding the Broccoli aptamer sequence enriched with a polyA fragment. The final RNA, together with its specific fluorogenic ligand, DFHBI-1T, was used to perform a fluorescence assay to determine the substrate preferences of seven selected decapping enzymes from different organisms. This part of the study also included kinetic measurements with the hDcp2 enzyme and cap-1 to determine the kinetic parameters of the reaction. The usefulness of the FLINT assay for finding inhibitors of decapping enzymes was also demonstrated. The determination of the activity range of individual enzymes was used to develop dually labeled fluorescent probes for a single molecular target, which was the focus of the second phase of my research. I began the synthesis of dually labeled fluorescent probes by preparing trinucleotide cap analogs, containing linkers that enable dye attachment. In this form, the cap analogues were cotranscriptionally inserted into the RNA strand and subsequently labeled with appropriate dyes. The second approach was the labeling of trinucleotides and then the IVT was performed as the next step. Regardless of the strategy adopted, the labeled and capped RNAs were subjected to labeling at the 3' end of the sequence, using either an enzymatic or chemical method. The dyes were chosen to form either fluorophore-quencher or donor-acceptor pairs, allowing observation of the FRET phenomenon. The fluorescent probes were characterized by biophysical methods, and those with the most favorable properties were also characterized for their suitability for monitoring enzymatic reactions with cap-degrading proteins. This work is important in the context of the development of new therapeutic approaches based on RNA molecules, where durability and stability are key elements.