Extension of the Aspherical Pseudoatom Databank Towards Nucleic Acids and its Application in Structural, Charge Density, and Energy Studies.

Mój projekt doktorski składa się z dwóch wyraźnie zarysowanych części. Pierwsza z nich obejmuje modyfikację i rozszerzenie banku asferycznych pseudoatomów UBDB (University at Buffalo Databank) wraz ze sprzężonym programem LSDB, a także testy stosowalności opracowywanej metody do szacowania właściwości elektrostatycznych molekuł. Druga część mojej pracy opiera się na użyciu nowej wersji banku w trzech różnych celach: (1) w celu rekonstrukcji rozkładu gęstości elektronowej makromolekuł, (2) jako źródła asferycznych atomowych czynników rozpraszania, a w końcu, (3) w celu przygotowania wstępnego modelu multipolowego w eksperymentalnych badaniach gęstości elektronowej. Zastosowanie banku UBDB jest tu punktem wyjścia do dalszych, szeroko zakrojonych rozważań z obszarów biochemii i inżynierii krystalicznej. W wyniku realizacji projektu przygotowałam nową wersję banku UBDB, rozszerzoną o atomy występujące w kwasach nukleinowych, DNA i RNA, a także innych ważnych biologicznie molekułach. Zmodyfikowałam również istniejące definicje atomowe. Nowy bank UBDB2011 zawiera obecnie ponad 200 różnych typów atomowych wymodelowanych na podstawie ponad 600 cząsteczek organicznych. Dodatkowo, równolegle do pracy nad bankiem, aktualizowałam i poprawiałam program LSDB odpowiedzialny za przypisywanie atomom lokalnych układów współrzędnych i nakładanie parametrów multipolowych przechowywanych w banku na wybraną molekułę o zadanej geometrii. Do bieżącej wersji kodu włączone są również zaktualizowane ‘średnie neutronowe’ długości wiązań z wodorem, X–H (X − atom niewodorowy), zgodnie z najnowszą publikacją Allen et al. 2010. Oczywiście program jest w pełni kompatybilny z istniejącą wersją banku. Nowa wersja LSDB, oprócz plików wejściowych do pakietu XD, automatycznie produkuje także pliki w formacie coraz powszechniej używanego pakietu MOPRO. Mając rozszerzoną wersję banku, UBDB2011, przeprowadziłam testy jego stosowalności do szacowania właściwości elektrostatycznych cząsteczek. Weryfikację przeprowadziłam na podstawie analizy elektrostatycznej energii oddziaływania zestawu kompleksów zawierających zasady azotowe lub reszty aminokwasowe. Okazało się, że metoda UBDB+EPMM (EPMM, ang. Exact Potential Multipole Method) w sposób satysfakcjonujący odzwierciedla wartości energii badanych układów w odniesieniu do obliczeń teoretycznych (ab initio i DFT). Korelacja między metodami była wysoka (R2 > 0.9, RMSD = 3.7 kcal•mol–1), natomiast zmienność energii zachowana. Ważną cechą metody bazującej na banku jest również uwzględnianie kierunkowości oddziaływań, co jest niezwykle ważne, a zaniedbywane przez metody oparte na ładunkach punktowych. Podejście UBDB+EPMM ma jednak kilka ograniczeń. Parametry przechowywane w banku nie odwzorowują efektów pola krystalicznego czy zmienności konformacyjnej molekuł. Dodatkowym ograniczeniem banku jest adekwatność definicji typów atomowych oraz metodologia zastosowana do obliczania parametrów gęstościowych (użyta baza funkcyjna, metoda DFT, obcięcie transformaty Fouriera, ograniczenia formalizmu Hansena-Coppensa itd.). W konsekwencji dokładność metody UBDB+EPMM wynosi około 5 kcal•mol–1. Ponadto bank UBDB2011 nie nadaje się do opisu niestandardowych molekuł, czy układów zawierających szereg sprzężonych wiązań podwójnych, co pokazałam na przykładzie cząsteczki amfoterycyny B. Przygotowany i przetestowany bank pseudoatomów otworzył mi drogę do drugiej części doktoratu. Jak już wspomniałam we wstępie, w tej części mojej pracy można wyodrębnić trzy oddzielne analizy. Pierwsza z nich jest poświęcona badaniu elektrostatyki oddziaływań w kompleksach neuraminidazy wirusa grypy z inhibitorami z wykorzystaniem UBDB2011, ze szczególnym uwzględnieniem udziału cząsteczek wody. W kolejnej zajęłam się tematyką serii pochodnych uracylu. Tu bank służył, jako źródło asferycznych czynników rozpraszania atomowego i został użyty w stosunkowo nowym typie udokładnienia struktury tzw. udokładnieniu TAAM (ang. Transferable Aspherical Atom Model). Ostatnie badanie polegało zaś na zastosowaniu banku do przygotowania startowego modelu gęstości elektronowej. Tu zajęłam się dwoma układami, dla których uzyskałam dane wysokorozdzielcze, tj. 6-metylo-2-tiouracylem i ko-kryształem komplementarnej pary zasad DNA 1-metylotyminy z 9-metyloadeniną. Badania układu neuraminidaza-inhibitor pokazały potencjał banku w analizie kompleksów biochemicznych oraz aktywności leków. Dzięki użyciu metody UBDB+EPMM możliwe było oszacowanie wkładów do całkowitej elektrostatycznej energii oddziaływania pochodzących od pojedynczych grup funkcyjnych ligandu, czy też poszczególnych aminokwasów części białkowej. W ten sposób łatwo jest zidentyfikować miejsce aktywne, czy kluczowe grupy funkcyjne limitujące, bądź wspomagające wiązanie inhibitora. Moim zadaniem było zbadanie wpływu cząsteczek wody na trwałość układu neuraminidaza-inhibitor. Udało mi się ustalić poglądowy udział rozpuszczalnika w stabilizacji kompleksu. To przyczyniło się po części do wytłumaczenia różnic w aktywności inhibicyjnej wybranych ligandów, która w niektórych przypadkach nie korelowała bezpośrednio z elektrostatyczną energią wiązania samego ligandu z białkiem. Takie badania mają większe znaczenie dla układów naładowanych, gdzie elektrostatyka przeważa w zdecydowany sposób nad innymi rodzajami oddziaływań. Takim właśnie układem był badany kompleks. Analiza serii 10 pochodnych uracylowych (uracylu, 1-metylouracylu, 1,5-dimetylouracylu, 2-tiouracylu, 4-tiouracylu, 2,4-ditiouracylu, 1-metylo-4-tiouracylu, 2-tio-5-metylouracylu, 2-tio-6-metylouracylu, 5-fluorouracylu) pokazała zaś wyższość udokładnienia typu TAAM nad standardowym udokładnieniem struktury w sferycznym modelu niezależnych atomów IAM (ang. Independent Atom Model). Badania energetyczne i geometryczne wykazały, że uzyskane przeze mnie geometrie cząsteczek z wykorzystaniem banku są bardzo zbliżone zarówno do tych uzyskanych z badań gęstościowych czy neutronowych, jak również do struktur periodycznie zoptymalizowanych w pakiecie CRYSTAL. Również w przypadku energii kohezji, czy oddziaływania motywów strukturalnych, trendy są zgodne z danymi teoretycznymi, podczas gdy wyniki dla struktur uzyskanych w metodzie IAM silnie od nich odbiegają. Moja analiza zaowocowała siedmioma dobrej jakości strukturami badanych układów, w tym jednej zupełnie nowej dla 4-tiouracylu. Wszystkie związki, poza 2,4-ditiouracylem, tworzą warstwy molekularne utrzymywane przez wiązania wodorowe i wzajemnie oddziaływujące za pomocą kontaktów π-elektronowych i z przewagą oddziaływań dyspersyjnych. Różnica energii kohezji między najstabilniejszym termodynamicznie 5-fluorouracylem a najmniej korzystną siecią krystaliczną 1-metylo-4-tiouracylu wynosi około 40 kJ•mol-1. Analiza energii motywów strukturalnych badanych związków pokazała wpływ grupy metylowej na stabilizację oddziaływań międzypłaszczyznowych oraz podstawnika siarkowego w pozycji 4 na jakość struktury. Również te dwa czynniki istotnie wpływają na wartości indeksów aromatyczności, NICS i HOMA, które jednak nie są wzajemnie zgodne. Wielkość energii deformacji molekuły przy przeniesieniu jej z próżni do sieci krystalicznej zależy natomiast od siły i liczby oddziaływań, w które zaangażowana jest dana cząsteczka. Dodatkowo analizowanym problemem okazał się szczególny motyw tworzony przez cząsteczki w strukturze 5-fluorouracylu. Tu atomy fluoru grupują się po cztery w tetramerycznym motywie. Na podstawie banku została odtworzona gęstość deformacyjna wskazująca na potencjalny udział stabilizujących kontaktów F…F typu ‘lump to hole’. Ostatnim tematem poruszanym w mojej pracy doktorskiej jest analiza rozkładu gęstości w kryształach zasad azotowych. Badania 6-metylo-2-tiouracylu pokazały, że bank UBDB może być wykorzystany nie tylko, jako startowy model gęstości elektronowej, ale może również być pomocny w przypadku analizy nieporządku w sieci. W moim badaniu UBDB2011 posłużył do wymodelowania problematycznego atomu siarki, oraz przyczynił się do wysnucia hipotezy o obecności okso-tiolowej formy tautomerycznej w badanej strukturze, tłumaczącej systematyczny błąd rejestrowany podczas analizy danych gęstościowych i zagadkowe piki resztowe wokół siarki. Badanie pokazało również, jak ostrożnym należy być przy interpretacji danych i dobieraniu modelu. Przypadek 6-metylo-2-tiouracylu i regularne kryształy, które tworzy, umożliwił znalezienie zależności między strukturą wewnętrzną kryształu a jego cechami makroskopowymi. Badanie pokazało także zgodność energii oddziaływań wodorowych uzyskanych na podstawie analizy topologicznej danych gęstościowych z tymi uzyskanymi z obliczeń teoretycznych. Podobną analizę przeprowadziłam dla ko-kryształu 9-metyloadeniny z 1-metylotyminą. Para zasad w krysztale występuje w nietypowym dla struktur kwasów nukleinowych kontakcie typu Hoogsteen-Watson-Crick (HW). Okazuje się, że pochodne adeniny wiążąc się w krysztale z modyfikacjami uracyli wykazują tendencję do tworzenia preferencyjnie właśnie tego motywu, podczas gdy nawet w cząsteczce RNA, o wiele bardziej labilnej niż DNA, tylko niewielki procent par zasad typu A:U występuje w takiej konfiguracji. Jednakże z obliczeń energetycznych wynika, że orientacja zasad typu HW jest nieznacznie stabilniejsza niż standardowe ustawienie typu Watsona-Cricka. Ponadto charakterystyka topologiczna rozkładu gęstości elektronowej układu jest zgodna z wynikami uzyskanymi dla analogicznych związków, np. 1-metylotymina tylko nieznacznie różni się od 6-metylouracylu przy porównaniu wspólnych fragmentów molekularnych. Podobnie, jak w 6-metylo-2-tiouracylu, również i w przypadku ko-kryształu energia wiązań wodorowych jest dobrze estymowana na podstawie parametrów topologicznych. Co więcej, model uzyskany bezpośrednio z banku, mimo że w detalach różny od eksperymentalnego rozkładu gęstości uzyskanego dla ko-kryształu, odzwierciedla satysfakcjonująco wielkość tych oddziaływań. Podsumowując, moja praca doktorska dostarczyła pełniejszej wersji narzędzi do opisu gęstości elektronowej cząsteczek, które z powodzeniem mogą być wykorzystywane zarówno do badania elektrostatyki układów makromolekularnych, jak i do poprawiania geometrii udokładnianych struktur czy w analizie gęstości elektronowej. Ponadto przeprowadzone badania uwypuklają zależności między geometrią układów, motywami strukturalnymi, energetyką sieci a morfologią. Większość wyników została już opublikowana w liczących się czasopismach (w sumie do tej pory jestem współautorką 11 publikacji), a ostatnie manuskrypty są w przygotowaniu. Kierunkami rozwoju wskazanymi przez wyniki moich badań może być analiza kompleksów makromolekularnych ważnych biologicznie, rozpowszechnianie użycia banku w udokładnieniu strukturalnym i jego dalszy rozwój lub też poszukiwanie lepszych modeli gęstości elektronowej w celu wyeliminowania przytoczonych wcześniej ograniczeń metody. Dodatkowo, ciekawą byłaby szersza analiza energetyczna, geometryczna i środowiskowa różnych połączeń zasad azotowych, a także ich oddziaływań z wodą, jonami metali i resztami cukrowymi. Przyczyniłoby się to do lepszego zrozumienia mechanizmów powstawania konkretnych kontaktów międzycząsteczkowych, także tych ważnych farmaceutycznie.

My PhD project consists of two clearly distinguishable parts. The first part includes modifications and extension of the aspherical pseudoatom databank, the UBDB (University at Buffalo Databank), and the related LSDB program. It also contains extensive tests of the databank applicability to the estimation of electrostatic properties of molecules. The second part of my Thesis is based on the use of the extended UBDB for the following scientific purposes: (1) reconstruction of the charge density distribution of macromolecules, which may constitute foundation for further estimation of electrostatic properties; (2) as a source of aspherical atomic scattering factors, which could be used in the structure refinement (so-called Transferable Aspherical Atom Model (TAAM) refinement);(3) as a starting model in the experimental charge density studies. The study is not just limited to databank-related scientific issues, but it also addresses subjects regarding the interrelations between geometry, energy, charge density and crystal morphology. Consequently, my study resulted in a new modified version of the UBDB databank extended with atoms required for modelling RNA and DNA molecules. The enhanced bank, the UBDB2011, now contains over 200 atom types present in the most relevant biochemical systems. Multipolar parameters stored in the databank were evaluated on the basis of over 600 organic molecules. During my work on the databank, I also modified the UBDB-related LSDB program, so as to include adequate atom type definitions, local coordinate systems, and updated X–H bond distances according to Allen et al. The LSDB now also writes automatically input files suitable for the MOPRO suite of programs, which is an alternative for the well-known XD package. Once the UBDB2011 version of the databank was ready, I extensively tested its applicability to estimating the electrostatic properties of chemical systems. The verification was based on the electrostatic interaction energy evaluation for a set of nucleic acid base and amino acid complexes, for which it was possible to run the reference ab initio calculations. I showed that the UBDB2011+EPMM (Exact Potential Multipole Method (EPMM)) method satisfactorily reproduces electrostatic interaction energies for a set of nucleic acid base complexes with respect to ab initio and/or DFT results (R2 > 0.9, RMSD = 3.7 kcal•mol–1). Correlations were found to be high, while energy trends were preserved. What is important, the UBDB databank enables taking the asphericity of atoms into consideration, therefore, unlike point-charge models, it addresses the directionality of atom–atom interactions. However, the UBDB+EPMM approach has a number of limitations. The databank parameters do not reproduce conformational variety, and do not include the crystal field influence, and some other subtle effects. The UBDB data is also constrained by the accuracy of atom type definitions and the charge density parameter computation method (basis set used, DFT method, Fourier truncation error, Hansen-Coppens model limitations, atom type definition adequacy, etc.). Consequently, when applied for electrostatic interaction energy evaluation, the UBDB2011+EPMM accuracy is of the order of 5 kcal•mol–1. Furthermore, the databank is not appropriate for describing charge density distribution of non-standard molecules, or systems containing alternated double bond fragments, which I showed using the example of Amphotericin B, and its iodoacetyl derivative. The prepared and tested UDBD2011 new databank opened up the possibilities for further studies. Thus, as mentioned in the preface, the second part of my Thesis can be divided into three separate sections. The first one is devoted to the electrostatic interaction investigations of influenza neuraminidase complexes with a series of inhibitors, with particular attention paid to the role of water molecules in the active site. The bank was used for charge density distribution reconstruction. In the second section, I focused on a set of 10 uracil derivatives. Here, the databank was applied as a source of atomic scattering factors in the TAAM refinement. Finally, I dedicated my attention to charge density studies, where I managed to obtain high resolution data, i.e. of 6-methyl-2-thiouracil (6m2tU), and a co-crystal of a complementary nucleic acid base pair, 1-methylthymine and 9-methyladenine (9mA:1mT). The studies of the neuraminidase-inhibitor complex revealed the databank potential in the analysis of biochemical systems and drug activities. Thanks to the UBDB+EPMM method, it was possible to estimate the partial contributions to the total electrostatic interaction energy coming from single fragments of ligand molecules, or from any selected aminoacid residue of the protein part. This way it is easy to identify the active site region (strongest interacting residues), or crucial atomic groups, limiting or stimulating the protein-inhibitor binding. My contribution was, though, directly related to the water molecule role in the neuraminidase active site. I succeeded to estimate the solvent influence on the complex stability. The results helped to explain some differences in the inhibition activity of selected ligands, which in certain cases were not correlated directly with the strength of electrostatic binding energy of ligand- protein complex. On the whole, such electrostatic interaction energy studies are most justified in the case of systems, where electrostatic interactions outweigh other interaction types. Influenza neuraminidase was a perfect case for such considerations. Subsequent the analysis of 10 uracil derivatives (i.e., uracil, 1-methyluracil, 1,5-dimethyluracil, 2-thiouracil, 4-thiouracil, 2,4-dithiouracil, 1-methyl-4-thiouracil, 2-thio-5-methylouracil, 2-thio-6-methyluracil, and 5-fluorouracil) revealed that the UBDB2011 databank works also very well as a source of atomic aspherical scattering factors. It occurred that TAAM refinement provides significantly more accurate molecular geometries than the standard IAM (Independent Atom Model) refinement. The energy and geometry studies showed that TAAM-derived molecular geometries are closer to those obtained from the experimental charge density studies and neutron measurement, but also to the periodically optimised structures within the CRYSTAL package. The TAAM cohesive energy and motif interaction energy trends are also in perfect agreement with the ones observed for optimised structures, whereas the IAM results differ significantly. My studies provided seven high quality structures, among which the 4-thio-uracil structure had not been earlier deposited in the CSD. All the investigated systems, apart from 2,4-dithiouracil, form layered architectures. The molecules within the layers are held by hydrogen bonds, whereas the molecular layers interact with one another via more dispersive in nature, however, significant contacts. The cohesive energy difference between the most thermodynamically stable 5-fluorouracil, and the least advantageous crystal lattice of 1-methyl-4-thiouracil, amounts to 40 kJ•mol-1. The analysis of structural motifs revealed the methyl group stimulation of stronger interlayer contacts, whereas the S4 substituent usually affects the stability and quality of the formed crystal. These two factors most substantially influence the aromaticity index values, HOMA and NICS. HOMA and NICS do not agree, though. The calculated deformation molecule energy between the isolated molecule and the molecule in a crystal lattice, depends on the strength and number of intermolecular interactions, in which this particular molecule participates, and can reach about 10 kJ•mol–1. I have additionally analyzed the interesting motif created by the fluorine atoms in the 5-fluorouracil (5fU) crystal lattice. Four 5fU molecules create a tetrameric motif with all the four fluorine atoms pointing into each other. On the basis of the databank, I have reconstructed the electron density of molecular fragments contributing to such a pattern. The derived deformation electron density indicated the potential stabilizing character of the F…F contact, of the ‘lump to hole’ type. The analysis of charge density distribution of nucleic acid base crystals constituted the last subject undertaken in my PhD Thesis. The project resulted in two high-resolution datasets, i.e., for 6-methyl-2-thiouracil and for the co-crystal structure of 1-methylthymine and 9-methyladenine. The 6m2tU studies showed that the databank can not only be applied as a starting charge density model, but can also be helpful in handling disorder in a crystal lattice. In my case, the UBDB2011 was used to model the problematic sulphur atom, and indicated the hypothesis of some content of the oxo-thiol 6m2tU tautomer exiting in the crystal lattice. This could explain systematic errors, which I observed during the charge density data analysis, and peculiar residual peaks visible in the vicinity of the sulphur atom. The study showed also that one has to be very careful with the modelling and data interpretation. On the other hand, regular and well-diffracting 6m2tU crystals allowed me to find the interrelations between charge density, energy and crystal morphology. It occurred that there is a connection between the crystal architecture features, and the macroscopic shape of the crystal. I have also found relations between crystal thermodynamic characteristics and crystal face stability, and crystal formation. Finally, good agreement was observed between the calculated hydrogen bond energy with that derived from the charge density in the Espinosa’s approach. The 9mA:1mT co-crystal constituted the last subject of my studies. Interestingly, the 9mA:1mT base pair does not form the standard Watson-Crick configuration in the crystal lattice, but the Hoogsteen-Watson-Crick base pair motif. It was also found out, that generally adenine derivatives when forming crystals with uracil species, tend to bind in this particular manner. At the same time, this kind of purine-pyrimidine orientation is rarely encountered even in the relatively labile RNA structures. Nonetheless, computational analysis results support slightly better stabilisation of the cHW-type dimers, than the standard cWW ones. The topological investigations gave very similar results to those obtained for the analogous molecules. What is more, the databank parameters reconstructed reasonably well the experimental charge density evaluated for 9mA:1mT, while the model satisfactorily reproduced the intermolecular interaction region. The 9mA:1mT is yet another crystal structure of layered architecture characterised by quite strong hydrogen bonds and effective π-stacking interactions. An interesting feature of the crystal network is the presence of close H…H contacts, which is not the case in the mono-component 1mT and 9mA crystals. To recapitulate, my PhD thesis provides extended and improved tools for charge density modelling, which can be successfully applied to electrostatic property study of macromolecules, for deriving more accurate structure geometries, or used in charge density analysis. Furthermore, my studies indicate the interrelations between geometry, structure motifs, lattice energy and crystal morphology. Most of the presented results have already been subjects of scientific articles (to date, I am a co-author of 11 publications). Last manuscripts, regarding these topics, are currently under preparation. The further development in the directions indicated by the presented studies concern the databank application to macromolecular systems, which are of biological importance. The UBDB databank and the idea of TAAM refinement should be popularised, as only the IAM refinement is widely applied, at present. Currently, the databank is being combined with the PHENIX package to enable the application of the TAAM procedure also to proteins. Investigations show that there should be some complementary methods provided to supplement the electrostatics derived on the basis of the databank, among which, also, solvent effects should be taken into account. On the other hand, one could consider alternative ways of accurate charge density modelling, free from the limitations of the UBDB databank, and also, the multipolar model. A comprehensive geometry, energy, and environment analysis of the non-standard nucleic acid base interactions, and also of other important factors, such as interactions with sugar moieties, phosphate groups, water or ion species seems interesting, too. This could give a better insight into the RNA binding properties, and may also lead to some pharmaceutical outcome.