Badania nad transportem biologicznie aktywnych anionów przez dwuwarstwy lipidowe za pomocą syntetycznych receptorów molekularnych

W niniejszej rozprawie doktorskiej przedstawione zostały wyniki badań syntetycznych receptorów molekularnych zdolnych do transportu ważnych biologicznie anionów przez dwuwarstwy lipidowe. Naturalnie występujące membrany fosfolipidowe stanowią trudną do przebycia barierę dla dużych, polarnych lub obdarzonych ładunkiem elektrycznym cząsteczek i jonów. Tymczasem transport jonów przez błony biologiczne jest kluczowy dla poprawnego funkcjonowania komórek i narządów. W naturze proces ten odbywa się najczęściej z pomocą wyspecjalizowanych białek transportowych, działających jako kanały lub nośniki. Wrodzone lub nabyte zaburzenie ich działania nierzadko prowadzi do rozwoju poważnych chorób, takich jak mukowiscydoza, zespół Barttera, cukrzyca i nowotwory. Syntetyczne transportery jonów, zwane jonoforami, to cząsteczki organiczne zdolne do przenoszenia jonów przez membrany lipidowe w postaci kompleksów supramolekularnych. Motywacją do ich badania jest perspektywa leczenia chorób spowodowanych dysfunkcją białek transportowych oraz ich interesująca aktywność biologiczna - wiele jonoforów wykazuje właściwości antybakteryjne oraz zabija komórki nowotworowe. Pracę rozpoczyna część wprowadzająca, w której określone zostały założenia oraz cele moich badań. W rozdziale pierwszym przedstawiono zarys aktualnego stanu wiedzy na temat transportu anionów w przyrodzie, syntetycznych anionoforów oraz na temat istniejących metod badania transportu anionów w liposomach. W skład rozdziału zatytułowanego „Badania własne” wchodzi opis trzech publikacji pierwszoautorskich, będących podstawą niniejszej rozprawy doktorskiej. W pierwszej z nich skupiłam się na badaniach transportu anionu chlorkowego, który jest najbardziej rozpowszechnionym anionem w roztworach fizjologicznych. Do badania transportu chlorków wykorzystałam otrzymane w naszym laboratorium syntetyczne receptory molekularne oparte na szkielecie diamidokarbazolu. Badając zależność aktywności transportowej od struktury chemicznej receptora wykazałam, że obecność podstawników silnie wyciągających elektrony (-NO2 i -CN) w pozycjach 3 i 6 jednostki karbazolowej ma decydujący wpływ na szybkość transportu chlorków przez membranę fosfolipidową. Ponadto, podstawniki takie zwiększają kwasowość donorów wiązań wodorowych, przez co aktywność transporterów staje się zależna od pH środowiska. W drugiej publikacji opisałam badania nad transportem wodorowęglanów, które odgrywają kluczową rolę w regulacji pH i w usuwaniu produktów przemiany materii. Wyniki prowadzonych przeze mnie badań pozwoliły po raz pierwszy oszacować względny udział różnych procesów (mechanizmów) w transmembranowym transporcie HCO3‒. W pracy tej wykazałam również, iż receptory na bazie diamidokarbazolu skutecznie wyrównują gradient pH i są jednymi z najbardziej aktywnych tego typu cząsteczek na świecie. We współpracy z mikrobiologami z Wydziału Biologii Uniwersytetu Warszawskiego wykazałam, że transportery na bazie karbazolu posiadają także właściwości antybakteryjne, co potwierdza aktywność biologiczną syntetycznych anionoforów. W trzeciej publikacji poruszyłam problematykę transportu aminokwasów. Choć w warunkach fizjologicznych aminokwasy występują głównie w postaci jonów obojnaczych, to prosta, monotopowa struktura badanego transportera skłoniła mnie do postawienia hipotezy, iż transportowana jest anionowa forma aminokwasu, pomimo niekorzystnej specjacji przy pH 7.4. Aby zweryfikować tę hipotezę, przeprowadziłam serię eksperymentów w podwyższonym pH, wykorzystując opracowaną przeze mnie metodę wykorzystującą wskaźnik fluorescencyjny SPQ. Dogłębne badania mechanistyczne, w połączeniu z wykazaną aktywnością innych literaturowych anionoforów w transporcie AA‒, otworzyły nową ścieżkę rozwoju syntetycznych transporterów aminokwasów.

This dissertation presents the results of my studies on simple synthetic molecular receptors capable of transporting biologically important anions across lipid bilayers. Naturally occurring phospholipid membranes provide a lipophilic barrier to large, polar, or electrically charged molecules and ions. However, the transport of ions across biological membranes is crucial for the proper functioning of cells and organs. In nature, this process is typically carried out by specialised proteins, which act as channels or carriers. Congenital or acquired malfunction of these proteins often leads to the development of serious diseases, such as cystic fibrosis, Bartter syndrome, diabetes, and cancer. Synthetic ion transporters, called ionophores, are organic molecules capable of transporting ions across lipid membranes in the form of supramolecular complexes. Their development is driven by the prospect of curing diseases caused by the dysfunction of transport proteins, as well as by their interesting biological activity – many ionophores have antibacterial and anticancer properties. The thesis begins with an introductory part that defines the assumptions and objectives of my research. The first chapter presents an overview of current knowledge about anion transport in nature, about synthetic anionophores, and about available methods for studying anion transport in liposomes. The chapter entitled "Own research" includes a description of three first-author publications that are the basis of this doctoral dissertation. In the first article, I focused on the transport of the chloride anion, which is the most common anion in physiological solutions. To transport chlorides, I used synthetic molecular receptors based on a diamidocarbazole scaffold, which were obtained in our laboratory. By examining the structure-activity relationship, I showed that the presence of strongly electron-withdrawing substituents (-NO2 and -CN) at positions 3 and 6 of the carbazole unit has a positive impact on the rate of transport of chloride across phospholipid membranes. Such substituents also increase the acidity of hydrogen bond donors, making the activity of transporters pH-dependent. In the second publication, I describe my studies on the transport of bicarbonate – an anion that plays a key role in regulating pH and removing metabolic products. The results of these studies allowed for the first time to estimate the relative contribution of various processes (mechanisms) to the transmembrane transport of HCO3‒. In this work, I also showed that diamidocarbazole-based receptors effectively equalise pH gradients and rank among the most active artificial protonophores known to date. In cooperation with microbiologists from the Faculty of Biology of the University of Warsaw, I showed that carbazole-based transporters also have interesting antibacterial properties, which confirms the biological activity of synthetic anionophores. In the third article, I addressed the issue of amino acid transport through lipid bilayers. Although under physiological conditions amino acids occur primarily as zwitterions, the simple, monotopic structure of the examined transporters led us to hypothesise that it is the anionic form of the amino acid that is transported, despite its low content at pH 7.4. To verify this hypothesis, I conducted a series of experiments at elevated pH using a method that I developed based on the SPQ fluorescent indicator. In-depth mechanistic studies confirmed our hypothesis, which, combined with evidence of the high activity of other literature anionophores in AA‒ transport, opens a new path for the development of synthetic amino acid transporters.