Comparing physical properties of aminoglycoside antibiotics' binding sites in RNA and proteins

Od ponad 60 lat antybiotyki aminoglikozydowe są z powodzeniem stosowane w szpitalach przeciwko ciężkim infekcjom bakteryjnym. Jednak pojawianie się coraz większej liczby przypadków bakterii opornych na stosowane aminoglikozydy sprawia, że badania mechanizmów oporności u bakterii stają kluczowe w dalszej skutecznej walce z infekcjami tego typu. Przeprowadziłam komputerowe symulacje biomolekuł, które oddziałują z antybiotykami aminoglikozydowymi we wnętrzu komórek bakteryjnych. Badanymi obiektami są: (i) główne miejsce wiązania aminoglikozydów, zwane miejscem A, w rybosomalnym RNA; natywne oraz z mutacjami powodującymi wzrost oporności u bakterii; a także (ii) enzymy modyfikujące aminoglikozydy (ang. aminoglycoside modifying enzymes, AME}), produkowane przez bakterie w celu chemicznej dezaktywacji tych leków. Motywacją do badań nad zmutowanym miejscem A był brak informacji o zmianach jakie zachodzą w fizycznych własnościach miejsca A po różnych zamianach nukleotydów. Wiadomo jakie mutacje prowadzą do oporności oraz że nawet pojedyncze zamiany nukleotydu mogą mieć bardzo wymierne skutki, ale nie wyjaśniono jakie są tego podstawy. Natomiast, w przypadku AME, celem prowadzenia symulacji było wyjaśnienie w jaki sposób ta grupa białek jest w stanie być jednocześnie bardzo zróżnicowana i wysoce specyficzna względem aminoglikozydów. Przeprowadziłam symulacje dynamiki molekularnej (MD) modelu miejsca A z wybranymi mutacjami oraz reprezentatywnych enzymów z trzech największych rodzin AME. Aby uzyskać opis oddziaływań między tymi miejscami wiążącymi a aminoglikozydami, przeprowadziłam również symulacje MD tych biomolekuł w kompleksach z wybranymi antybiotykami. W celu analizy symulacji użyłam metodologii z zakresu biofizyki teoretycznej. Badałam wiele własności fizykochemicznych wybranych biomolekuł i ich kompleksów, m.in.: dynamikę wewnętrzną, własności elektrostatyczne, kształt i objętość miejsc wiązania aminoglikozydów, a także rodzaje oddziaływań z aminoglikozydami. Ponadto, stworzyłam nową metodę analizy zmian konformacyjnych w molekułach, która dokonuje podziału biomolekuł na tzw. dynamiczne domeny, na podstawie danych pochodzących z symulacji lub eksperymentów. Z analizy symulacji rybosomalnego miejsca A wynika, że mutacje różnych zasad wpływają na różne własności fizyczne tego fragmentu RNA. W zależności od położenia mutowanej zasady, zmieniał się rozkład ładunków cząstkowych w miejscu wiążącym lub kształt tego miejsca. Mutacje wpływały również na dynamikę ruchów wewnętrznych miejsca A. Analiza symulacji cząsteczek AME wskazała, że oprócz różnorodności struktur trzeciorzędowych i sekwencji, występuje w tej grupie również różnorodność w ruchach wewnętrznych. Pomimo tych różnic, wszystkie enzymy oddziaływały z aminoglikozydami w bardzo podobny sposób, głównie elektrostatycznie. Ponadto, te oddziaływania wydają się być kopiowane z kompleksów, jakie aminoglikozydy tworzą z miejscem A. Rezultaty moich badań są zgodne z poprzednimi doniesieniami eksperymentalnymi, a także pomagają wyjaśnić niektóre z nich. Wyniki opisane w tej pracy mogą być podstawą do zaprojektowania zmodyfikowanych aminoglikozydów, które mogłyby być aktywne nawet wobec opornych bakterii.

Aminoglycoside antibiotics have been in use for more than 60 years, helping combat severe bacterial infections. Due to this long time of usage, more and more bacteria become resistant to one or several drugs from this group. This spread of resistant species is alarming and additionally, there is little knowledge about the mechanisms of bacterial resistance. In order to broaden our understanding of how bacteria combat aminoglycosides, we performed computer simulations of various molecules that bind aminoglycosides in a bacterial cell: (i) the primary binding site, called the A-site and located in ribosomal RNA, wild type and with mutations that decrease the aminoglycoside binding affinity; and (ii) the aminoglycoside modifying enzymes (AMEs), which are produced by bacteria to inactivate these drugs. The mutations of the RNA A-site were chosen based on previous experimental studies on whole bacteria. These studies showed that even single base substitutions were sufficient to make bacteria resistant, but did not explain how this resistance was gained on an atomic level. There are many AMEs and they vary a lot among themselves, yet they all have a narrow specificity towards aminoglycosides, which are quite homogeneous group. The two main questions we have posed in our research are: (i) what are the physical grounds of bacteria becoming less susceptible to aminoglycosides due to RNA A-site mutations; and (ii) how different AMEs attract aminoglycosides and interact with them? We performed all-atom molecular dynamics (MD) simulations of the A-site model with selected mutations and of AME representatives. In addition, the complexes of these biomolecules with aminoglycosides were simulated. For comparison, we also performed simulations of the wild type A-site model and of the aminoglycosides in water. We used various biophysical methods to analyze these simulations and to study: internal dynamics of the biomolecules; electrostatic potential, shape, and volume of the binding pockets; types of interactions with aminoglycosides; and changes in conformations of aminoglycosides. In addition, we developed and implemented an algorithm that helps describe molecular motions. We found that different A-site mutations affect different features of the RNA binding site. Some of them changed the mobility of the nucleic bases, and therefore the shape of the A-site was altered. Other mutations changed the electrostatic potential inside the binding site, thus making it almost unrecognizable to aminoglycosides. The study of AMEs showed that apart from their structural and sequence-related diversity, they differ in the internal movement patterns. However, these enzymes interact with aminoglycosides very similarly, using mainly electrostatic interactions. Interestingly, we noticed that these interactions were copied from the RNA:aminoglycoside complex. Our findings were in agreement with experimental studies and also helped to explain some of their outcomes. The results presented in this dissertation may help design new antibiotics that would overcome the bacterial resistance.