Praca doktorska
Ładowanie...
Oznaczanie małych peptydów za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej sprzężonej ze spektrometrią mas w aspekcie badań antydopingowych
| dc.abstract.pl | Celem niniejszej pracy było opracowanie, udoskonalenie oraz walidacja metod oznaczania peptydów o masie <2kDa w próbkach moczu ludzkiego za pomocą chromatografii cieczowej sprzężonej ze spektrometrią mas, na potrzeby analizy antydopingowej. Ze względu na specyfikę chemiczną badanej grupy peptydów, a w szczególności ich niską stabilność w roztworach oraz materiałach biologicznych, konieczne były rozszerzone, niestandardowe, a tym samym zaawansowane badania pozwalające na optymalizację parametrów analitycznych zaproponowanej procedury pomiarowej. W ramach badań wstępnych skoncentrowano się na ograniczeniu efektu utraty analitów w trakcie przygotowania próbek do dalszej analizy instrumentalnej. Szczególną uwagę zwrócono na etapy obarczone wysokim ryzykiem wystąpienia wspomnianych efektów, przede wszystkim etapów przechowywania próbek oraz procesu odparowania. Oceniono wpływ temperatury, rodzaju zastosowanych materiałów zużywalnych, dodatku substancji stabilizujących, czy wpływ ciśnienia i ekspozycji próbek na dostęp powietrza. Zebrane dane stanowiły podstawę wyboru warunków przygotowania próbek stosowanych w dalszej części badań. Kolejny etap to weryfikacja możliwości zastosowania klasycznych metod przygotowania próbek do analizy związków niskocząsteczkowych techniką LC-MS/MS pod kątem wiarygodności uzyskiwanych wyników. Wytypowane procedury poddano szczegółowej walidacji, zgodnej z wymaganiami stawianymi metodom przesiewowym i potwierdzającym stosowanym w kontroli antydopingowej. Dwie z nich wdrożono do zakresu akredytacji laboratorium i z powodzeniem stosowano podczas testów biegłości stanowiących element polityki jakości Światowej Agencji Antydopingowej. Efektem przeprowadzonej walidacji było opracowanie metod, które umożliwiają oznaczanie znacznie większej liczby metabolitów badanych peptydów, w porównaniu do opisanych w literaturze. Co więcej, dzięki zastosowaniu uniwersalnej metody przygotowania próbek jaką jest SPE, w połączeniu z łagodnymi warunkami odparowania, zaproponowane metody mają charakter otwarty i mogą znaleźć zastosowanie do analizy płynów ustrojowych pod kątem oznaczania innych substancji o właściwościach zasadowych występujących w formie niezwiązanej, w tym związków termolabilnych. Z kolei użycie techniki LC-MS/MS pozwala skuteczne i szybkie rozdzielenie oraz identyfikację analitów, a w konsekwencji na wysoką przepustowość metody, kluczową zarówno dla analiz antydopingowych, jak i np. badań klinicznych, toksykologicznych czy analizy próbek zabezpieczonych w postępowaniach sądowych. Celem ostatniej części badań było wskazanie potencjalnego markera lub markerów obecnych w moczu, po jednorazowym lub wielokrotnym doustnym podaniu ochotnikom heksareliny. Wykorzystanie wysokorozdzielczej spektrometrii mas pozwoliło na identyfikację heksareliny oraz jej metabolitów w próbkach zebranych przez uczestników badania. Z kolei analiza techniką UHPLC-MS/MS posłużyła do opisania po raz pierwszy profilu eliminacji heksareliny drogą nerkową po doustnym podaniu peptydu. Oprócz waloru poznawczego, zgromadzone dane znalazły zastosowanie aplikacyjne, ponieważ wykazano, że monitorowanie heksareliny oraz metabolitu 1-3, FA pozwala na istotne wydłużenie okna wykrywalności po doustnym podaniu peptydu. Udowodniono również, że zaproponowana metoda jest komplementarna do metody rutynowo stosowanej w laboratoriach antydopingowych, ponieważ umożliwia potwierdzenie przyjęcia peptydu w dawce nie wpływającej na stężenie hormonów P-III-NP i IGF-1 we krwi. |
| dc.abstract.pl | This work aimed to develop, improve and validate analytical methods for the determination of peptides with molecular weight <2kDa in human urine samples using liquid chromatography coupled with mass spectrometry for anti-doping analysis. Due to the specificity of the tested group of substances, particularly their low stability in solutions and biological materials, a non-standard and more comprehensive approach to optimizing the analytical procedure has been applied. Preliminary studies focused on analyte loss reduction during high-risk stages of the sample preparation process - storage and evaporation - assessing the impact of such factors as temperature, materials of consumables used, the addition of stabilizing substances, pressure, and air access. The collected data formed the basis for the choice of conditions used in the later part of the research. The next step was to verify whether classic sample preparation techniques, used for LC-MS/MS analysis for low molecular weight compounds in human urine, would apply to small peptide determination. The main criterion was the reliability of the method. Selected procedures were then validated in compliance with the requirements for screening and confirmatory methods used in the anti-doping analysis. Afterwards, two of the methods were included in the laboratory's accreditation scope and successfully applied during proficiency tests that are part of the quality policy of the World Anti-Doping Agency. The proposed methods are noteworthy because they cover more metabolites of the tested compounds than previously described methods. Additionally, the developed methods use a universal technique for sample preparation combined with mild evaporation conditions, making it possible to determine other substances with alkaline properties present in an unbound form in body fluids, including thermolabile compounds. In turn, the use of the LC-MS/MS technique allows effective separation and identification of analytes during a short instrumental analysis, resulting in high throughput of the method, which is vital in such fields as doping control, clinical and toxicological analysis, and testing of the samples secured by police or customs. The final objective of the study was to find potential biomarkers in urine samples collected from participants who had received either a single dose or multiple doses of hexarelin. High-resolution mass spectrometry allowed the detection of hexarelin and its metabolites in the collected samples. Additionally, UHPLC-MS/MS analysis was conducted to determine the renal elimination profiles of hexarelin after oral administration of the peptide for the first time. The collected data had not only cognitive but also practical value. Screening for hexarelin 1-3, FA along the parent compound resulted in a significant extension of the detection window following oral administration of the peptide. Furthermore, the proposed method was proven to be complementary to the classic approach used by anti-doping laboratories as it allows confirmation of the peptide's intake in a dose that does not affect the concentration of effectors of growth hormone (P-III-NP and IGF-1) in the blood. |
| dc.affiliation.department | Wydział Chemii |
| dc.contributor.author | Wojtkowiak, Katarzyna |
| dc.date.accessioned | 2023-12-05T07:34:21Z |
| dc.date.available | 2023-12-05T07:34:21Z |
| dc.date.defence | 2023-12-15 |
| dc.date.issued | 2023-12-05 |
| dc.description.additional | Link archiwalny https://depotuw.ceon.pl/handle/item/4816 |
| dc.description.promoter | Bulska, Ewa |
| dc.description.promoter | Kwiatkowska, Dorota |
| dc.identifier.uri | https://repozytorium.uw.edu.pl//handle/item/4816 |
| dc.rights | ClosedAccess |
| dc.subject.pl | identyfikacja metabolitów |
| dc.subject.pl | metabolity heksareliny |
| dc.subject.pl | LC-MS/HRMS |
| dc.subject.pl | LC-MS/MS |
| dc.subject.pl | niskocząsteczkowe peptydy |
| dc.subject.pl | substancje zabronione |
| dc.subject.pl | antydoping |
| dc.subject.pl | metabolite identification |
| dc.subject.pl | hexarelin metabolites |
| dc.subject.pl | LC-MS/HRMS |
| dc.subject.pl | LC-MS/MS |
| dc.subject.pl | low molecular weight peptides |
| dc.subject.pl | prohibited substances |
| dc.subject.pl | anti-doping |
| dc.title | Oznaczanie małych peptydów za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej sprzężonej ze spektrometrią mas w aspekcie badań antydopingowych |
| dc.title.alternative | Determination of small peptides by means of liquid chromatography coupled with mass spectrometry in view of doping control analysis |
| dc.type | DoctoralThesis |
| dspace.entity.type | Publication |