Effects of macromolecular crowding on the activity and dynamics of the NS3/4A protease from the hepatitis C virus. The synergy between experiments and molecular dynamics simulations.

Zarówno eksperymenty biochemiczne jak i symulacje białek prowadzone są zwykle w rozcieńczonych roztworach takich jak bufory lub woda z jonami soli. Tymczasem naturalne środowisko w którym funkcjonują białka stanowi zupełnie inne środowisko; na przykład cytoplazma żywych komórek w 30-40% zajęta jest przez makromolekuły takie jak RNA i białka. Taki poziom zatłoczenia może wpływać na dyfuzję i dynamikę konformacyjną białek, a więc również pośrednio na ich aktywność enzymatyczną. W tej pracy opisuję badania wpływu zatłoczonego środowiska na proteazę NS3/4A z wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV), która jest przykładem białka posiadającego wewnętrznie nieustrukturyzowane fragmenty. Takie białka stanowią prawie połowę wszystkich białek, i nawet większą część enzymów wirusów, które wykorzystują te fragmenty do wiązania i przejmowania kontroli nad strukturami komórkowymi i enzymami infekowanego organizmu. Nieustrukturyzowane fragmenty białek zyskują bardziej uporządkowane konformacje w kontakcie z makromolekułami z którymi oddziałują, lub pod wpływem zmian w otaczającym je środowisku. Z tego powodu mogą być one szczególnie podatne na wpływ zatłoczenia molekularnego. Aby lepiej zrozumieć molekularne mechanizmy wpływu zatłoczenia na NS3/4A, połączyłam analizę eksperymentów laboratoryjnych i symulacji prowadzonych w analogicznych warunkach. W obu przypadkach proteaza była obserwowana w wodzie, oraz w obecności glikolu polietylenowego (PEG) i polisacharozy. Oba polimery należą do cząsteczek najczęściej wykorzystywanych do modelowania zatłoczonego środowiska w doświadczeniach laboratoryjnych, ale prawie nigdy nie są włączane do symulacji dynamiki molekularnej (MD). Aby podzielić obserwowane efekty na te spowodowane wyłącznie przez ograniczenie przestrzeni, i te wynikające z oddziaływania z cząsteczkami modelującymi zatłoczone środowisko (crowderami), dodatkowo przeprowadziłam symulacje proteazy otoczonej gruboziarnistymi pseudo-cząsteczkami, które oddziałują z białkiem w minimalnym stopniu. Dzięki połączeniu obserwacji układu w dwóch skalach – miliardów białek w eksperymentach biofizycznych i jednego białka w symulacjach, udało się zaproponować mechanizm molekularny odpowiedzialny za bardzo różny wpływ PEG i polisacharozy na aktywność NS3/4A. Symulacje MD w wodzie i w otoczeniu różnych crowderów wykazały również, że zatłoczone środowisko może wpływać na funkcje biologiczne proteazy. Dzięki stabilizacji prekursora helisy transbłonowej na N-końcowym fragmencie NS4A, zatłoczone środowisko wewnątrz komórki ludzkiej ułatwia proces zakotwiczenia kompleksu NS3/4A w błonie lipidowej. Niniejsza praca opisuje jedną z pierwszych symulacji MD białka w otoczeniu pełnoatomowych crowderów PEG, oraz pierwszą symulację białka w otoczeniu polisacharozy reprezentującej wykorzystany w eksperymentach Ficoll. Ten polimer powszechnie uważany jest za nie wykazujący oddziaływań z białkami, jednakże w trajektoriach uzyskanych z modelem polisacharozy można zauważyć wiele kontaktów i wiązań wodorowych między crowderami a badanym białkiem. Nowe techniczne metody opisane w pracy obejmują parametryzację pełnoatomowych modeli polimerów PEG i polisacharozy w taki sposób, aby zapobiec ich agregacji w symulacji wielu molekuł, a także opisanie modelu sferycznych gruboziarnistych crowderów, które mogą być wykorzystane w wieloskalowych symulacjach z wodą i białkiem w reprezentacji pełnoatomowej.

As a standard, both laboratory experiments and simulations of proteins, especially enzymes, are conducted in diluted solutions like buffers or water with ions. However the cytoplasm of a living cell, where the proteins function in nature, provides quite a different environment, with around 30$\%$ of the volume taken by macromolecules like RNA, proteins and lipids. Such level of crowding can affect diffusion and conformational dynamics of the proteins, and thus also indirectly affect their activity. In this thesis I describe investigation of how does crowded environment affect the NS3/4A protease from Hepatitis C virus, which is an example of a protein containing an intrinsically disordered region (IDPr). Such proteins make up almost a half of all proteins, and even larger proportion of viral enzymes. Viruses exploit IDPr to widen a range of functionalities within a very limited number of proteins, by binding to and taking over cellular structures and proteins of the host. Unstructured protein fragments gain more ordered conformations upon approaching binding partners or under changing environment, and so they might be especially prone to be affected by crowding. To better understand the molecular mechanisms of the effects of crowding on NS3/4A, I combined analysis of laboratory experiments and simulations conducted in analogical conditions. In both cases the protease was observed in water and in the presence of polyethylene-glycol (PEG) and polysucrose. These polymers are among the most often used crowder molecules in the laboratory assays, but hardly ever included in molecular dynamics (MD) simulations. In order to divide observed effects into those caused by volume exclusion and by protein-crowder interactions, I additionally simulated the protease surrounded with coarse-grained crowders of my design. Thanks to combining observations in two scales - of billions of proteins in the activity assay and one protein in the simulations, I was able to propose a molecular mechanism behind the opposite effects of PEG and Ficoll on the NS3/4A activity, and discover that crowded environment may influence biological functions of the protease, by stabilising a precursor of transmembrane helix at the terminus of NS4A protein - this way facilitating the process of anchoring the protease to the host membrane. I also found that polysucrose crowders, widely thought to be an inert, non-interacting crowder, actually engage in multiple contacts and hydrogen bonds with the studied protein. New technical methods described in the thesis include parameterisation of all-atom PEG and polysucrose models, that maintain realistic diffusion in the simulations of multiple molecules, and also a design of a spherical bead-shell coarse-grained crowder, that can be used in multi-scale MD simulations with explicit water.