Praca doktorska
Miniatura
Pliki
MCieplak-Rotowska_summary.pdf269.99 KB
MCieplak-Rotowska_rec_ZSzweykowska-Kulinska.pdf3.12 MB
MCieplak-Rotowska_streszczenie.pdf368.76 KB
MCieplak-Rotowska_thesis.pdf20.01 MB
MCieplak-Rotowska_rec_JPoznanski.pdf5.33 MB
Licencja
ClosedAccessDostęp zamknięty
 

Biophysical and molecular biology studies of proteins involved in gene silencing

Uproszczony widok
dc.abstract.enThis thesis provides biophysical bases of the interactions between two proteins involved in microRNA (miRNA)-mediated silencing: CNOT1 and the silencing domain of GW182. The regulation of gene expression at the post-transcriptional level involves the crucial CCR4-NOT deadenylase complex, which deadenylates mRNA, and can also inhibit translation in an independent fashion. In miRNA-mediated silencing, the CCR4-NOT complex is brought into the vicinity of the target mRNA by the successive actions of the miRNA, the Argonaute protein and finally, the GW182 protein, which interacts directly with CCR4-NOT. In the case of silencing of mRNAs containing AU-rich elements, the same action is performed by the protein called tristetraprolin involved in the regulation of inflammatory processes. The interactions and interplay between all of these high molecular weight proteins are relatively poorly understood. In particular, the interaction sites between GW182 and the CCR4-NOT complex were previously unknown. Molecular biology experiments allowed the identification of CCR4-NOT interaction motifs on GW182. One of them is crucial for deadenylation, while the other is vital in mediating the interaction with CCR4-NOT via CNOT1, the scaffolding subunit of the CCR4-NOT complex. Biophysical experiments based on hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry allowed the identification of the corresponding binding site on CNOT1(800-999). Surprisingly, the binding site of the GW182 silencing domain was found to be at the same CNOT1(800-999) surface region as the binding site of tristetraprolin. Biochemical experiments excluded their simultaneous binding to CNOT1. The GW182 and tristetraprolin proteins share a common motif, RLPXφ, that interacts with CNOT1 in a very similar, but not identical, manner. This sequence has been proposed to act as a short linear motif. Thus, the two different gene silencing pathways: miRNA-mediated silencing and ARE-mediated silencing intersect at CNOT1, which serves as a molecular hub. The structural dynamics of the GW182 silencing domain and the CNOT1(800-999) fragments were also studied. The GW182 silencing domain was experimentally proved to be natively unstructured except for an RNA-recognition motif (RRM) domain. The GW182 RRM domain was found to be a loose structure, contrary to the CNOT1(800-999) structure that was found to be very rigid. Experiments performed in this thesis have led to the discovery of the interaction sites between the natively disordered GW182 silencing domain and the helical CNOT1(800-999) protein fragment, contributing to the understanding of the molecular mechanisms of recognition within protein complexes involved in gene silencing in different physiological processes.
dc.abstract.plNiniejsza praca doktorska dotyczy biofizycznych podstaw oddziaływania między białkami zaangażowanymi w wyciszanie ekspresji genów przez mikro-RNA (miRNA), a mianowicie pomiędzy białkiem CNOT1 a domeną wyciszającą białka GW182. W procesie wyciszania ekspresji genów przez miRNA, cząsteczki te wiążą się z białkiem Argonaute i naprowadzają je na cząsteczkę mRNA, która ma ulec wyciszeniu. Z białkiem Argonaute oddziałuje białko GW182, które z kolei wiąże się z kompleksem deadenylaz CCR4-NOT. Kompleks ten deadenyluje mRNA oraz może także blokować jego translację, co łącznie prowadzi do wyciszenia ekspresji danego genu. Z kolei w wyciszaniu mRNA zawierających sekwencje bogate w adeninę i urydynę, rolę miRNA wraz z Argonaute i GW182 pełni białko o nazwie tristetraprolina, które odgrywa kluczową rolę w procesach odpowiedzi na stany zapalne. Oddziaływania pomiędzy składnikami tego skomplikowanego układu białek o wielkich masach cząsteczkowych są jeszcze stosunkowo słabo poznane. W szczególności, nieznane były miejsca odpowiedzialne za tworzenie kompleksu pomiędzy GW182 a CCR4-NOT. Doświadczenia z zakresu biologii molekularnej pozwoliły na identyfikację miejsc wiążących CCR4-NOT w sekwencji domeny wyciszającej białka GW182. Jedno z nich ma kluczowy wpływ na deadenylację, a drugie - kluczowy wpływ na oddziaływanie z kompleksem CCR4-NOT za pośrednictwem jego centralnej podjednostki CNOT1. Badania biofizyczne metodą wymiany wodór-deuter sprzężoną ze spektrometrią mas pozwoliły z kolei na identyfikację miejsca oddziaływania GW182 na białku CNOT1 (we fragmencie 800-999), które, niespodziewanie, okazało się bardzo dobrze pokrywać z miejscem oddziaływania CNOT1(800-999) z tristetraproliną. Eksperymenty biochemiczne wykazały, że białka te konkurują o miejsce oddziaływania na CNOT1(800-999). Białka GW182 i tristetraprolina oddziałują z CNOT1 wykorzystując ten sam motyw sekwencji, RLPXφ, w bardzo podobny, jednak nie identyczny sposób. Sekwencja ta prawdopodobnie działa jako tzw. krótki motyw liniowy (z ang. short linear motif, SLiM). Zatem te dwa szlaki kontroli nad ekspresją genów krzyżują się. W pracy zbadano także dynamikę strukturalną białka CNOT1(800-999) oraz domeny wyciszającej białka GW182. Wykazano eksperymentalnie, że białko GW182 ma nieustrukturyzowany charakter, oprócz domeny wiążącej RNA (RRM), która ma strukturę bardzo dynamiczną. Natomiast białko CNOT1(800-999) charakteryzuje się stabilną, ściśle upakowaną strukturą. Przeprowadzone badania doprowadziły do odkrycia miejsc oddziaływania pomiędzy natywnie nieustrukturyzowaną domeną wyciszającą GW182, a helikalnym fragmentem białka CNOT1(800 999), przyczyniając się do zrozumienia molekularnych mechanizmów rozpoznawania w kompleksach białkowych odpowiedzialnych za regulację ekspresji genów w różnych procesach komórkowych.
dc.affiliation.departmentWydział Fizyki
dc.contributor.authorCieplak-Rotowska, Maja
dc.date.accessioned2017-11-18T00:05:56Z
dc.date.available2017-11-18T00:05:56Z
dc.date.defence2017-12-11
dc.date.issued2017-07-10
dc.description.additionalLink archiwalny https://depotuw.ceon.pl/handle/item/2368
dc.description.osid96174
dc.description.promoterNiedźwiecka, Anna
dc.identifier.apd14260
dc.identifier.urihttps://repozytorium.uw.edu.pl//handle/item/2368
dc.language.isoen
dc.rightsClosedAccess
dc.subject.enhydrogen-deuterium exchange
dc.subject.enelectrospray ionization
dc.subject.enion mobility
dc.subject.enmass spectrometry
dc.subject.enabsorption and emission spectroscopy
dc.subject.enfluorescence
dc.subject.enliquid chromatography
dc.subject.enbioinformatics
dc.subject.entitration
dc.subject.enCNOT1
dc.subject.enCCR4-NOT deadenylase complex
dc.subject.enGW182
dc.subject.enmicroRNA-mediated gene silencing
dc.subject.entristetraprolin
dc.subject.enARE-mediated silencing
dc.subject.enRNA-recognition motif
dc.subject.ensilencing domain
dc.subject.enproteins
dc.subject.enpeptides
dc.subject.enintermolecular interactions
dc.subject.enintrinsically disordered protein
dc.subject.ennatively unstructured protein
dc.subject.enshort linear motif
dc.subject.enstructural dynamics
dc.subject.enbinding site
dc.subject.enamide hydrogens
dc.subject.enconformational change
dc.subject.enbiophysics
dc.subject.enmolecular biology
dc.subject.enbiochemistry
dc.subject.plwymiana wodór-deuter
dc.subject.plelektrorozpylanie
dc.subject.plspektrometria ruchliwości jonów
dc.subject.plspektrometria mas
dc.subject.plspektroskopia absorpcyjna i emisyjna
dc.subject.plfluorescencja
dc.subject.plchromatografia cieczowa
dc.subject.plbioinformatyka
dc.subject.plmiareczkowanie
dc.subject.plCNOT1
dc.subject.plkompleks deadenylaz CCR4-NOT
dc.subject.plGW182
dc.subject.plwyciszanie ekspresji genów przez mikro-RNA
dc.subject.pltristetraprolina
dc.subject.plwyciszanie ekspresji genów zawierających sekwencje bogate w adeninę i urydynę
dc.subject.pldomena wiążąca RNA
dc.subject.pldomena wyciszająca
dc.subject.plBiałka
dc.subject.plpeptydy
dc.subject.ploddziaływania międzycząsteczkowe
dc.subject.plbiałko wewnętrznie nieuporządkowane
dc.subject.plbiałko natywnie nieustrukturyzowane
dc.subject.plkrótki motyw liniowy
dc.subject.pldynamika strukturalna
dc.subject.plmiejsce wiązania
dc.subject.plproton amidowy
dc.subject.plzmiany konformacyjne
dc.subject.plbiofizyka
dc.subject.plbiologia molekularna
dc.subject.plbiochemia
dc.titleBiophysical and molecular biology studies of proteins involved in gene silencing
dc.title.alternativeBadania białek zaangażowanych w wyciszanie ekspresji genów metodami biofizyki i biologii molekularnej
dc.typeDoctoralThesis
dspace.entity.typePublication