Praca doktorska
Miniatura
Pliki
0000-DR-253963-praca.pdf4.59 MB
Licencja
FairUseKorzystanie z tego materiału możliwe jest zgodnie z właściwymi przepisami o dozwolonym użytku lub o innych wyjątkach przewidzianych w przepisach prawa. Korzystanie w szerszym zakresie wymaga uzyskania zgody uprawnionego.
 

Komputerowa analiza przepływu jonów przez antyporter EcCLC i kanał potasowy ROMK oraz identyfikacja miejsca wiążącego fosfatydyloinozytole w kanale ROMK

Uproszczony widok
dc.abstract.plTransportery jonowe odpowiedzialne są za utrzymywanie homeostazy komórki oraz biorą udział w regulowaniu ważnych procesów komórkowych takich jak: skurcz mięśni, przewodnictwo neuronalne, czy rozwój komórek i ich różnicowanie. Z drugiej strony, białka te mogą być używane w czujnikach elektrochemicznych i modyfikowanych elektrodach. W niniejszej pracy zbadano mechanizmy transportu jonów przez dwa transportery w dwóch różnych środowiskach. Jednym z nich był antyporter EcCLC (z bakterii Escherichia coli), odpowiedzialny za transport jonów chlorkowych, równocześnie transportujący protony w przeciwnym kierunku, który był badany w lipidowych fazach kubicznych. Z kolei ludzki kanał ROMK, którego rolą jest transport jonów potasowych, był analizowany w modelu błony komórkowej. Kanał ROMK najistotniejszą rolę spełnia w nerkach, gdzie jego dysfunkcja może prowadzić do choroby zwanej zespołem Barttera. Wydaje się również, że kanał ten stanowi por mitochondrialnego kanału mitoKATP. Dokładne poznanie procesu transportu jonów przez kanał ROMK oraz sposobu jego modulacji przez główny aktywator, 4,5-bisfosforan fosfatydyloinozytolu (PIP2), jest kluczowa, aby, w celach medycznych, mieć możliwość wpływania na aktywność ROMK. Jednym z głównych celi badań prezentowanych w tej rozprawie było scharakteryzowanie porów w antyporterze EcCLC i kanale ROMK metodami in silico. Przy pomocy symulacji dynamiki molekularnej zidentyfikowane zostały drogi transportu jonów chlorkowych w EcCLC i potasowych w ROMK oraz kluczowe aminokwasy dzielące drogi transportu tych jonów na kolejne etapy. Pozwoliło to na identyfikację bramek obu białek transportujących. Innym celem badań było określenie architektury miejsca wiążącego PIP2 w kanale ROMK oraz wskazanie istotnych dla tego oddziaływania aminokwasów. W celu identyfikacji tych aminokwasów, obok dokowania i symulacji dynamiki molekularnej, opracowano nowy wysokoprzepustowy test oparty o wzrost bakterii eksprymujących mutanty kanału ROMK i syntetyzujących fosfatydyloinozytole. Test ten walidowano określając fenotyp mutantów kanału ROMK odpowiedzialnych za zespół Barttera. Za jego pomocą zweryfikowano opracowany in silico model miejsca wiążącego PIP2 w kanale ROMK.
dc.abstract.plIon transporters are responsible for maintaining cell homeostasis and are involved in regulating important cellular processes such as muscle contraction, neuronal conduction, or cell development and their differentiation. On the other hand, these proteins can be used in electrochemical sensors and modified electrodes. In this work, the mechanisms of ion transport by two transporters in two different environments were investigated. One of them was the EcCLC antiporter (from bacteria Escherichia), responsible for the transport of chloride ions, and, at the same time, protons transport in the opposite direction, which was studied in lipid cubic phases. In turn, the human ROMK channel, which role is to transport potassium ions, was analyzed in a cell membrane model. The most important role ROMK plays in the kidneys, where its dysfunction leads to a disease called Bartter's syndrome. This channel also appears to be the pore of the mitochondrial KATP channel. Understanding the process of ion transport through the ROMK channel and how it is modulated by the main activator (PIP2 – phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate) is crucial to influence ROMK activity for medical purposes. One of the main goals of the research presented in this dissertation was to characterize the pores in the EcCLC antiporter and the ROMK channel with in silico methods. With the help of molecular dynamics simulations, the transport pathways of chloride ions in EcCLC and potassium ions in ROMK were identified, as well as the key amino acids dividing the transport routes of these ions into subsequent stages. This allowed the identification of the gates of both transport proteins. Another aim of the research was the determination of the architecture of the PIP2 binding site in the ROMK channel and the indication of amino acids essential for this interaction. To identify these amino acids, in addition to docking and molecular dynamics simulation, a new high-throughput assay was developed based on the growth of bacteria expressing ROMK channel mutants and synthesizing phosphatidylinositols. This assay was validated by determining the phenotype of the ROMK channel mutants responsible for Bartter syndrome. In the end, this assay was used to validate the in silico model of the PIP2 binding site in the ROMK channel.
dc.affiliation.departmentWydział Chemii
dc.contributor.authorMożajew, Mariusz
dc.date.accessioned2023-06-20T06:32:25Z
dc.date.available2023-06-20T06:32:25Z
dc.date.defence2023-06-30
dc.date.issued2023-06-20
dc.description.additionalLink archiwalny https://depotuw.ceon.pl/handle/item/4628
dc.description.promoterFilipek, Sławomir
dc.description.promoterKoprowski, Piotr
dc.identifier.urihttps://repozytorium.uw.edu.pl//handle/item/4628
dc.language.isopl
dc.rightsFairUse
dc.subject.plzespół Barttera
dc.subject.plkanały chlorkowe
dc.subject.plPIP2
dc.subject.plROMK
dc.subject.plkanały potasowe
dc.subject.pldynamika molekularna
dc.titleKomputerowa analiza przepływu jonów przez antyporter EcCLC i kanał potasowy ROMK oraz identyfikacja miejsca wiążącego fosfatydyloinozytole w kanale ROMK
dc.title.alternativeComputer analysis of ion flow through the EcCLC antiporter and ROMK potassium channel and identification of the phosphatidylinositol binding site in the ROMK channel
dc.typeDoctoralThesis
dspace.entity.typePublication