The use of bacteriophages for binding and synthesis of metal nanoparticles

Nanotechnologia obejmuje projektowanie, wytwarzanie i wykorzystywanie materiałów, urządzeń i systemów poprzez manipulowanie strukturą materii na poziomie pojedynczych atomów i molekuł, w nanoskali. Nanoskala jest umownie definiowana jako zakres wielkości od 1 do 100 nm. Nanotechnologia położyła podwaliny pod przełomowe innowacje w niemal wszystkich gałęziach przemysłu i doprowadziła do powstania nowych rynków. W jej rozwoju niektórzy upatrują nowej rewolucji przemysłowej i zmiany paradygmatu w nauce i technice. Gdy rozmiar cząstki lokuje się w nanoskali, uwidaczniają się nowe, fizyczne, chemiczne, mechaniczne lub optyczne cechy materiału, co otwiera nietradycyjne, fascynujące perspektywy jego zastosowań. Istotą nanonauki i nanotechnologii jest zrozumienie i wykorzystanie właśnie takich właściwości materiałów. Przedmiotem mojego zainteresowania były nanomateriały nieorganiczne, nanocząstki tlenku metalu (ZnO) i metalu szlachetnego (złota), cechujące się szerokim zakresem zastosowań praktycznych. Głównym celem pracy było wykazanie możliwości ich wytworzenia w łagodnych warunkach, metodami syntezy biogenicznej, w oparciu o zastosowanie bakteriofagów (fagów) – wirusów infekujących bakterie i archeony – oraz peptydów. Najpowszechniej stosowanymi metodami wytwarzania nanocząstek są metody chemiczne i fizyczne, które nie są jednak optymalne w odniesieniu do wszystkich obszarów zastosowań projektowanych nanocząstek. Zyskujące popularność, przyjazne środowisku metody biogeniczne sprzyjają m. in. utrzymaniu biokompatybilności wytworzonych nanomateriałów do ich dalszych zastosowań praktycznych. Praca ma charakter interdyscyplinarny, a jej tematyka, przyjęta strategia oraz zastosowane techniki eksperymentalne leżą na styku biologii molekularnej, inżynierii genetycznej oraz nanotechnologii i jej dwóch specjalności: fizyki i chemii materiałów. Słowa kluczowe: "bionanotechnologia" i "nanobiomateriały" wydają się najlepiej odzwierciedlać, odpowiednio: rodzaj stosowanych narzędzi (wykorzystanie narzędzi biotechnologicznych dla potrzeb nanotechnologii) i osiągnięte efekty (wytworzenie przy użyciu jednostek biologicznych – fagów – użytecznych człowiekowi materiałów nieorganicznych funkcjonujących w nanoskali). Aby osiągnąć cel pracy, drogą przeszukiwania bibliotek peptydów o losowych sekwencjach aminokwasowych, prezentowanych na powierzchni fagów (ang. phage display), zidentyfikowałam in vitro i scharakteryzowałam dwa nieopisane wcześniej liniowe dodekapeptydy silnie i specyficznie wiążące nanocząstki ZnO (TMGANLGLKWPV) albo Au (HLYLNTASTHLG). Z wykorzystaniem technik inżynierii genetycznej skonstruowałam warianty rekombinowanego faga M13 eksponujące zidentyfikowane peptydy na powierzchni wirionów, w obrębie białek pIII lub pVIII kapsydu. Tak skonstruowane fagi posłużyły do zsyntetyzowania, z prekursorów Zn(OH)2 i HAuCl4, w łagodnych warunkach reakcji i bez konieczności użycia silnych, konwencjonalnych reduktorów (np. powszechnie stosowanego NaBH4), nanocząstek ZnO i nanocząstek Au, których rozmiar i geometrię można kontrolować modyfikując parametry procesu. Rozwiązanie to wyróżnia fakt skutecznego użycia czynników biologicznych (fagów) w podwójnej roli w opracowanej, biogenicznej metodzie syntezy nanocząstek: proces namnażania rekombinowanego faga w hodowli bakteryjnej umożliwia biogeniczną syntezę peptydu (co stanowi metodę łatwo skalowalną i nieszkodliwą dla środowiska), a namnożony rekombinowany fag prezentujący peptyd umożliwia następnie biosyntezę nanocząstek. W celu scharakteryzowania wytworzonych nanostruktur użyłam obrazowania w mikroskopach" TEM, SEM i AFM. Przeprowadziłam także szeroko zakrojoną analizę spektralną nanostruktur z użyciem spektroskopii: absorpcyjnej, luminescencyjnej, rentgenowskiej z dyspersją energii, fourierowskiej oraz dyfrakcji promieniowania rentgenowskiego. W przypadku wytworzonych nanocząstek ZnO, zademonstrowałam możliwość ich wykorzystania w praktyce jako funkcjonalnego materiału luminezującego. W przypadku wytworzonych nanocząstek Au, wykazałam ich modyfikowalne właściwości plazmoniczne, możliwość wytrącania z roztworu lub agregacji w wyniku oddziaływań z rekombinowanym fagiem – cechy o potencjale wykorzystania w aplikacjach środowiskowych, biologicznych i medycznych, m. in. w oparciu o zjawiska powierzchniowego wzmocnienia rozpraszania Ramana (SERS) lub wzmocnienia emisji indukowanej agregacją (AIEE). Uzyskane wyniki poszerzają naszą wiedzę o możliwościach zastosowania fagów w nanotechnologii oraz o mechanizmach i warunkach tworzenia nanocząstek i ich oddziaływań z peptydami. Wskazują również na możliwość praktycznego zastosowania zarówno skonstruowanych, rekombinowanych fagów, jak i otrzymanych z ich użyciem nanocząstek ZnO i Au.

Nanotechnology encompasses the design, fabrication, and application of materials, devices, and systems at the nanoscale, commonly defined as the size range from 1 to 100 nm. Nanotechnology and nanomaterials have provided a foundation for transformative innovations that have created new markets and disrupted some existing industries. These far-reaching effects have led some to view nanotechnology as the new industrial revolution or a paradigm shift in science and technology. Nanoparticles exhibit unique physical, chemical, mechanical, and optical properties that are substantially different from those of larger particles of the same material. The most commonly used methods for fabricating nanoparticles are chemical and physical approaches. Limitations of these methods include, but are not limited to, concerns about the biocompatibility of the engineered nanoparticles for downstream biomedical applications, as well as environmental and regulatory considerations. Biogenic or "green" methods of nanoparticle synthesis can address these limitations and have emerged as viable alternatives to physical and chemical methods. The aforementioned challenges, as well as the intriguing, tunable properties of nanomaterials, inspired me to take a multidisciplinary approach to inorganic nanoparticle synthesis at the intersection of biotechnology (including the use of bacteriophages and novel material-specific peptides) and materials engineering. I was particularly interested in inorganic nanomaterials, namely metal oxide (ZnO) and noble metal (gold) nanoparticles, as metal and metal oxide nanoparticles are the most widely used engineered nanostructures in real-life applications. The primary aim of my work was to demonstrate the possibility of their biogenic synthesis under mild conditions using bacteriophages (phages) and peptides, both of which are considered nanomaterials themselves (albeit of organic origin). To achieve the goal of this work, I first screened phage-displayed random peptide libraries and I identified two novel linear dodecapeptides that strongly and specifically bind either ZnO (TMGANLGLKWPV) or Au (HLYLNTASTHLG) nanoparticles. Using genetic engineering, I constructed variants of recombinant M13 phage that expose the identified foreign peptides on their virion surfaces as part of the pIII or pVIII capsid proteins. I then developed a method in which these engineered phages served as sustainable molecular factories to synthesize ZnO and Au nanoparticles from Zn(OH)2 and HAuCl4 precursors, respectively, under mild reaction conditions and in the absence of strong, conventional reducing agents (such as the commonly used NaBH4). Thus, I demonstrated the biofabrication of inorganic nanomaterials whose size and morphology could be tailored by modifying the process conditions. To characterize the resulting nanoparticles, I used TEM, SEM, and AFM microscopy imaging as well as extensive spectral analysis using absorption spectroscopy, luminescence spectroscopy, energy dispersive X-ray spectroscopy, Fourier-transform infrared spectroscopy, and X-ray diffraction methods. In the case of phage-derived ZnO nanoparticles, I demonstrated their potential application as a functional luminescent material that emits light near the short wavelength end of the visible spectrum (at ca. 400 nm). In the case of phage-derived Au nanoparticles, I demonstrated their tunable plasmonic properties and their phage-controlled precipitation or aggregation – features with potential for future environmental, biological, and medical applications based on surface-enhanced Raman scattering (SERS) or aggregation-induced emission enhancement (AIEE) effects. The developed phage-peptide system combines the ability of the pIII or pVIII phage coat proteins to self-assemble into a well-defined architecture with the precise Au or ZnO recognition features of the two identified peptides. Unlike previous reports of nanoparticle fabrication using phage-display-selected peptides, this work features engineered phages that play a dual role in the syntheses. First, the propagation of the peptide-presenting phage in a bacterial culture enables biogenic synthesis of the desired peptide (which is an easily scalable and environmentally benign method). Second, the propagated, peptide-presenting phage then enables the biofabrication and manipulation of Au or ZnO nanoparticles. Taken together, the results of this work expand our knowledge of the use of phages in nanotechnology, as well as of the mechanisms and conditions for nanoparticle formation and their interactions with peptides. The results also indicate the application capacity of both the engineered phages and the phage-derived ZnO and Au nanoparticles.