Changes in auxin and cytokinin metabolism in ammonium-grown Arabidopsis plants

Rośliny mogą pobierać z podłoża azot nieorganiczny w formie jonów azotanowych (NO3–) i amonowych (NH4+). Asymilacja NO3– wymaga większych nakładów energii w porównaniu do asymilacji NH4+. Jednak gdy NH4+ są jedynym źródłem azotu, rośliny wykazują objawy tzw. syndromu amonowego przejawiającego się m.in. zahamowaniem wzrostu organów. Jednym z charakterystycznych objawów fenotypowych żywienia amonowego jest zmiana pokroju systemu korzeniowego. Korzenie roślin uprawianych w obecności NH4+ są wprawdzie krótsze, ale bardziej rozgałęzione. Rozwój organów roślinnych jest w dużej mierze determinowany przez metabolizm fitohormonów, w tym auksyn i cytokinin. W ramach pracy doktorskiej podjęto próbę określenia, w jakim stopniu zmiany w metabolizmie auksyn i cytokinin wywołane żywieniem amonowym mogą przyczyniać się do obserwowanych różnic w pokroju organów rzodkiewnika pospolitego (Arabidopsis thaliana). Określono m.in. różnice w poziomie ekspresji genów kodujących enzymy zaangażowane w ścieżki syntezy, koniugacji i degradacji tych fitohormonów. Oznaczono również stężenie różnych form auksyn i cytokinin w korzeniach i liściach rzodkiewnika uprawianego przez osiem tygodni w obecności NH4+ lub NO3– (warunki kontrolne) jako źródła azotu. Badania biochemiczno-molekularne zostały uzupełnione o badania mikroskopowe z wykorzystaniem mutantów rzodkiewnika. Pozwoliły one na wizualizację intensywności szlaków sygnałowych auksyn i cytokinin oraz tkankowo specyficznej ekspresji transporterów auksyn. Stwierdzono, że żywienie amonowe skutkuje ogólnie wyższym stężeniem wolnych auksyn, jak również ich koniugatów. W przypadku różnych form cytokinin nie zaobserwowano tak wyraźnego trendu zmian, jednak stwierdzono, że stres amonowy powoduje obniżenie stężenia najbardziej aktywnej biologicznie formy cytokinin – trans-zeatyny. Podobnie jak w przypadku auksyn, również poziom koniugatów cytokinin był znacznie wyższy u roślin uprawianych w obecności NH4+ w porównaniu z roślinami kontrolnymi uprawianymi w obecności NO3–. Zaobserwowano również różnice w ekspresji konstruktów reporterowych szlaków odpowiedzi na auksyny i cytokininy. Zmiany te były szczególnie widoczne w częściach wierzchołkowych korzeni głównych – żywienie amonowe spowodowało niższy poziom odpowiedzi na auksyny oraz wyższy poziom odpowiedzi na cytokininy. Udokumentowano również, że stres amonowy indukuje istotne zmiany w poziomie ekspresji białek transporterowych z rodziny PIN-FORMED w korzeniu głównym i korzeniach bocznych rzodkiewnika. Co więcej, wykazano, że niższe pH apoplastu komórek może promować pasywny napływ auksyn do komórki w warunkach żywienia amonowego. Bazując na uzyskanych wynikach można wnioskować, że zmiany w poziomie aktywnych fizjologicznie auksyn i cytokinin, wynikające z modyfikacji intensywności procesów syntezy i degradacji tych fitohormonów oraz istotne zmiany w intensywności transportu auksyn w obrębie systemu korzeniowego, mogą być istotną przyczyną różnic fenotypowych występujących u rzodkiewnika w odpowiedzi na żywienie amonowe.

Plants can absorb inorganic nitrogen from the soil in the form of nitrate (NO3–) and ammonium (NH4+) ions. NO3– assimilation requires more energy compared to NH4+ assimilation. However, when NH4+ is the sole nitrogen source, plants exhibit symptoms of the so-called ammonium syndrome, manifested by, among other things, inhibited growth of organs. A characteristic phenotypic symptom of NH4+ nutrition is a change in the root system architecture: the roots of plants grown in the presence of NH4+ are shorter but more branched. The development of plant organs is largely determined by the metabolism of phytohormones. In this doctoral dissertation, an attempt was made to determine to what extent changes in the metabolism of auxins and cytokinins induced by NH4+ nutrition can contribute to the observed differences in the morphology of Arabidopsis thaliana organs. Differences in the expression levels of genes encoding enzymes of the biosynthesis, conjugation, and degradation pathways of these phytohormones were determined, as well as the concentrations of different forms of auxins and cytokinins in the roots and leaves of Arabidopsis grown for eight weeks in the presence of NH4+ or NO3– (control conditions) as the nitrogen source. Biochemical and molecular studies were supplemented with microscopic analyses, which allowed visualization of the intensity of auxin and cytokinin signaling pathways and tissue-specific expression of auxin transporters. It was found that NH4+ nutrition generally results in higher concentrations of free auxins and their conjugates in Arabidopsis tissues. In the case of different biologically active forms of cytokinins, no clear trend of changes was observed. However, ammonium stress was found to reduce the concentration of the most biologically active form of cytokinin – trans-zeatin. Similarly to auxins, the level of cytokinin conjugates was significantly higher in plants grown in the presence of ammonium ions compared to control plants grown in the presence of nitrates. Expression of reporter constructs of auxin and cytokinin response pathways was also altered. These changes were particularly visible in the apical parts of the primary roots – NH4+ nutrition caused a lower response level for auxins and a higher response level for cytokinins. It was also documented that NH4+ stress induces significant changes in the expression levels of PIN-FORMED transporter proteins in the primary and lateral roots of Arabidopsis. Moreover, it was shown that the lower pH of the cell apoplast can promote passive auxin influx into the cell under NH4+ nutrition. Based on the obtained results, it can be concluded that changes in the levels of physiologically active auxins and cytokinins, resulting from modifications in the intensity of the biosynthesis and degradation processes of these phytohormones, and significant changes in the intensity of auxin transport within the root system, may be the cause of the phenotypic differences observed in Arabidopsis under NH4+ nutrition conditions.