Praca doktorska
Ładowanie...
Licencja
Korzystanie z tego materiału możliwe jest zgodnie z właściwymi przepisami o dozwolonym użytku lub o innych wyjątkach przewidzianych w przepisach prawa. Korzystanie w szerszym zakresie wymaga uzyskania zgody uprawnionego.Badanie chiralnych superstruktur amyloidowych
| dc.abstract.en | Protein misfolding may lead under certain conditions to formation of amyloid β-sheet fibrils. These phenomenon is associated with several diseases, such as Alzheimer’s disease or Creutzfeldt-Jakob disease, but also with functional biological processes occurring in living organisms. The aim of investigations conducted for this thesis was to elucidate a specific aspect of protein aggregation – formation of chiral superstructures by misfolded insulin. The chiral superstructures are a highly-ordered assemblies of amyloid fibrils exhibiting anomalously intensive circular dichroism (CD) signals. Their chiroptical properties may be observed in electron and vibrational spectral regions and by application of extrinsic markers, such as tioflavin T (ThT). The goal of experimental works was to characterize this processes closer and to explain the observed chiroptical effects. A wide range of biophysical methods has been applied during this research, such as CD spectroscopy, infrared spectroscopy, kinetic measurements with fluorescent markers specific for amyloids, vibrational CD spectroscopy and atomic force microscopy. Chiral amyloid superstructures are formed during aggregation of insulin upon intensive mixing and the observed chiroptical effects are very strong. The performed experiments demonstrated that the contribution of the effects that might generate artifacts, such as linear dichroism, dispersion and birefringence is minor and doesn’t dominate in the measured signal. It has been showed, that NaCl has a crucial role in chiral aggregation, but also that pre-formed single fibrils in the presence of NaCl may assemble into associates resembling chiral superstructures. This implies that this might be a stable polymorphic insulin amyloid strain that might me be obtained under different conditions. Also a fragment of insulin amino acid sequence responsible for the chiral aggregation has been identified and it has been elucidated why chiral aggregation has observed only for insulin. It has been also determined that the sign of signal for chiral samples is the same in the spectral regions corresponding to electronic and vibrational transitions, so the chirality of aggregates is visible on different levels of amyloid structure. Unexpectedly it has been also determined, that thioflavin T may form a non-fluorescent complex with α-helical form of polyglutamic acid – before that it has been believed, that this dye binds proteins and polypeptides only in amyloid β-sheet form. The conducted research explains critical physico-chemical and structural factors that enable chiral aggregation of insulin. The results of this work extend the understanding of molecular self-organisation which leads to unusual structural forms of proteins and polypeptides. These findings are important both for understanding of the process of protein aggregation, but also for possible applications of chiral superstructures as molecular scaffolds in nanoengineering. |
| dc.abstract.pl | Białka mogą ulegać nieprawidłowemu zwijaniu, co niekiedy prowadzi do powstania β-kartkowych fibryli amyloidowych. Zjawisko to jest związane z przebiegiem szeregu chorób, takich jak choroba Alzheimera czy choroba Creuztfeldta-Jakoba, ale także z biologicznie funkcjonalnymi procesami zachodzącymi w organizmach. Celem badań przeprowadzonych w ramach mojej pracy doktorskiej było pogłębienie wiedzy na temat szczególnego aspektu agregacji białek – powstawania chiralnych superstruktur z nieprawidłowo zwiniętych cząsteczek insuliny. Chiralne superstruktury są wysoce uporządkowanymi asocjatami włókien amyloidowych, wykazującymi anomalnie intensywne widma dichroizmu kołowego (ang. circular dichroism - CD). Ich chiralooptyczne właściwości mogą być obserwowane w elektronowym i wibracyjnym zakresie promieniowania oraz przy pomocy zewnętrznych znaczników interkalujących w tych strukturach, takich jak tioflawina T (ThT). Celem przeprowadzonych prac eksperymentalnych było bliższe scharakteryzowanie tego procesu oraz wyjaśnienie obserwowanych efektów chiralooptycznych. W badaniach wykorzystana została szeroka gama metod biofizycznych – m.in. spektroskopia dichroizmu kołowego, spektroskopia w podczerwieni, kinetyczne pomiary z użyciem markerów fluorescencyjnych specyficznych wobec amyloidów, spektroskopia wibracyjnego dichroizmu kołowego oraz mikroskopia sił atomowych. Chiralne superstruktury amyloidowe powstają w trakcie agregacji insuliny podczas intensywnego mieszania a obserwowane efekty chiralooptyczne mają dużą intensywność. Przeprowadzone eksperymenty pokazały, że udziały efektów mogących generować artefakty optyczne – tj. dichroizmu liniowego, dwójłomności bądź rozpraszania światła nie dominują w mierzonym sygnale. Wykazano kluczową rolę NaCl w chiralnej agregacji, ale także możliwość asocjacji wcześniej utworzonych, pojedynczych włókien amyloidowych insuliny w obecności NaCl w skupiska przypominające chiralne superstruktury. Oznacza to, że mogą one być stabilną odmianą polimorficzną agregatów insuliny, przybieraną w pewnych warunkach. Zidentyfikowano także fragment sekwencji aminokwasowej insuliny odpowiedzialny za chiralną agregację i określono dlaczego zjawisko to zaobserwowano dotychczas jedynie dla insuliny. Następnie określono, że znak próbek w pomiarach w zakresie elektronowym pokrywa się ze znakiem rejestrowanym w zakresie podczerwieni, a więc ich chiralność jest widoczna też na innym poziomie budowy amyloidu. Niespodziewanie odkryto także możliwość tworzenia się niefluorescencyjnego kompleksu tioflawiny T z α-helikalną formą kwasu poliglutaminowego - dotychczas sądzono, że barwnik ten wiąże się z białkami i polipeptydami jedynie w postaci β-kartki amyloidowej. Przeprowadzone badania przyczyniły się do lepszego zrozumienia krytycznych czynników fizykochemicznych i strukturalnych umożliwiających zajście chiralnej agregacji insuliny. Wyniki tych prac przekładają się na pełniejsze zrozumienie szczególnego rodzaju samoorganizacji molekularnej prowadzącej do powstania nietypowych form strukturalnych białek i polipeptydów. Wyciągnięte wnioski są istotne zarówno pod kątem zrozumienia procesu agregacji białek jak i w kontekście potencjalnych zastosowań chiralnych superstruktur jako rusztowań molekularnych w nanoinżynierii. |
| dc.affiliation.department | Wydział Chemii |
| dc.contributor.author | Babenko, Viktoria |
| dc.date.accessioned | 2015-06-22T10:50:01Z |
| dc.date.available | 2015-06-22T10:50:01Z |
| dc.date.defence | 2015-07-02 |
| dc.date.issued | 2015-06-22 |
| dc.description.additional | Link archiwalny https://depotuw.ceon.pl/handle/item/1182 |
| dc.description.promoter | Dzwolak, Wojciech |
| dc.description.promoter | Woźniak, Krzysztof |
| dc.identifier.uri | https://repozytorium.uw.edu.pl//handle/item/1182 |
| dc.language.iso | pl |
| dc.rights | FairUse |
| dc.subject.en | circular dichroism |
| dc.subject.en | chirality |
| dc.subject.en | aggregation |
| dc.subject.en | amyloids |
| dc.subject.pl | dichroizm kołowy |
| dc.subject.pl | chiralność |
| dc.subject.pl | agregacja |
| dc.subject.pl | amyloidy |
| dc.title | Badanie chiralnych superstruktur amyloidowych |
| dc.type | DoctoralThesis |
| dspace.entity.type | Publication |