Analiza struktury i funkcji chromidów wybranych gatunków bakterii z rodzaju Paracoccus (Alphaproteobacteria)

Podstawowa informacja genetyczna, determinująca funkcje niezbędne do wzrostu i podziałów komórkowych bakterii, zawarta jest w chromosomie. Cechą charakterystyczną genomów wielu bakterii jest występowanie replikonów pozachromosomowych. Replikony pozachromosomowe, zaliczane najczęściej do grupy plazmidów, niosą informację dodatkową, która nie jest niezbędna do prawidłowego funkcjonowania komórek gospodarzy. U niektórych bakterii doszło jednak do przeniesienia, w wyniku rekombinacji, części genów metabolizmu podstawowego z chromosomu do współwystępujących plazmidów, co doprowadziło do powstania niezbędnych komórce replikonów (chromidów) o właściwościach typowych zarówno dla plazmidów, jak i chromosomu. Chociaż chromidy występują dość powszechnie (m.in. u wielu bakterii ważnych z punktu widzenia człowieka), zjawisko podziału niezbędnej informacji genetycznej między kilka replikonów oraz wpływ tych rearanżacji na biologię i ewolucję bakterii, nie zostały dotąd dokładnie zbadane. Brak spójnej, jednoznacznej definicji „niezbędności” genu oraz niedoskonałość metod umożliwiających identyfikację replikonów niezbędnych, bardzo często stwarzają trudności w zaklasyfikowaniu replikonów pozachromosomowych do grupy plazmidów bądź chromidów. Bakterie należące do rodzaju Paracoccus (Alphaproteobacteria), zasiedlające powszechnie rozmaite środowiska, mają genomy o strukturze wieloreplikonowej. W niniejszej pracy podjęto próbę identyfikacji chromidów w dwóch szczepach Paracoccus (P. kondratievae NCIMB 13773 i P. aminophilus JCM 7686) oraz zdefiniowania informacji genetycznej determinującej właściwości tych replikonów. Do identyfikacji chromidów wykorzystano zjawisko niezgodności systemów replikacyjnych (ang. incompatibility), co pozwoliło na wskazanie replikonów, których nie można usunąć z komórki. Badania przeprowadzone w P. kondratievae NCIMB 13773 wykazały jednak, że kryterium nieusuwalności nie może być jedyną podstawą wyróżniania chromidów, ze względu na częste występowanie w replikonach pozachromosomowych efektywnych systemów stabilizujących, powodujących posegregacyjną eliminację komórek pozbawionych danego replikonu. W trakcie badań wykazano, że wysoka stabilność replikonu pKON1 P. kondratievae (95 049 pz) wynika z obecności właśnie tego typu systemu, kodującego toksynę (HipA) i antytoksynę (HipB). Ponieważ replikon ten nie zawiera genów metabolizmu podstawowego, został on zaliczony do grupy plazmidów. Stosując analogiczne podejście metodyczne, w genomie P. aminophilus JCM 7686 zidentyfikowano dwa replikony pozachromosomowe, ważne dla wzrostu i prawidłowego funkcjonowania komórek tej bakterii. Pierwszy z nich (pAMI5, 294 013 pz) to replikon nieusuwalny w testowanych warunkach. Ponieważ nie można go usunąć, nawet po wyeliminowaniu wpływu obecnego w jego obrębie systemu toksyna-antytoksyna, jest prawdopodobne, że niesie on geny metabolizmu podstawowego, bez których bakteria nie może żyć. Drugi replikon (pAMI6, 206 582 pz) udało się usunąć z komórek gospodarza, jednak uzyskany w ten sposób szczep charakteryzował się znacznym spowolnieniem wzrostu na podłożu pełnym oraz utratą zdolności do wzrostu na podłożu minimalnym. Zatem pAMI6 niesie geny istotne dla wzrostu, co niewątpliwie wpływa na konkurencyjność P. aminophilus w środowisku naturalnym. Obydwa replikony niosą liczne geny występujące w chromosomach blisko spokrewnionych bakterii. Zaproponowano, aby zarówno pAMI5, jak i pAMI6, zaliczyć do grupy chromidów. Jednak, ze względu na zaobserwowane różnice między nimi, pAMI5 nazwano chromidem pierwszorzędowym (obligatoryjnie niezbędnym), a pAMI6 – chromidem drugorzędowym (fakultatywnie niezbędnym). W trakcie badań wykazano również, że informacja genetyczna zawarta w obrębie chromidów P. aminophilus JCM 7685 determinuje charakterystyczne cechy metaboliczne tego szczepu. Obydwa replikony niosą pulę genów, których produkty są zaangażowanych w metylotrofię (zdolność do wykorzystania związków C1 - zredukowanych związków węgla niezawierających wiązań węgiel-węgiel), która umożliwia zasiedlenie i przeżycie komórek gospodarza w jego naturalnej niszy, tj. glebie zanieczyszczonej N,N-dimetyloformamidem (związek C1). Ponieważ analizowane chromidy zawierają informację genetyczną umożliwiającą zajmowanie typowej dla danej bakterii niszy ekologicznej, stanowią one tzw. replikony determinujące styl życia (ang. lifestyle-determining replicons).

The presence of extrachromosomal replicons is a characteristic feature of many bacterial genomes. While the genetic information essential for growth and division of bacterial cells is located within the chromosome, the extrachromosomal replicons, usually classified as plasmids, can provide functions that are critical for the survival of a bacterium in a specific environment, however, they are not indispensable for the viability of the host cells. Comparative genomic studies revealed that in many bacterial genomes some housekeeping genes have been transferred from the chromosome into the co-occurring plasmids. This phenomenon has led to the generation of essential extrachromosomal replicons, called chromids, sharing features of both chromosomes and plasmids. Although chromids have been identified in the genomes of many well-studied pathogenic and biotechnologically-relevant strains, the biological significance of such genome rearrangement has not yet been thoroughly investigated. The unclear concept of “essentiality” of some genetic information and the lack of a unified methodology for the identification of essential replicons make it difficult to formulate an exact definition of a chromid. The representatives of the genus Paracoccus (Alphaproteobacteria) are widespread both in pristine and polluted environments. The genetic information of many Paracoccus spp. strains is dispersed between chromosome and numerous extrachromosomal replicons. The main aim of this study was to identify essential extrachromosomal replicons (chromids) within two Paracoccus strains (P. kondratievae NCIMB 13773 and P. aminophilus JCM 7686) and to define the genetic information responsible for the specific features of these replicons. Chromids have been distinguished from plasmids by the attempts to remove individual extrachromosomal replicons from a cell with the use of the target-oriented, replicon curing technique. However, such an analysis performed in P. kondratievae NCIMB 13773 revealed that such a method of determination of replicon “essentiality” is not sufficient to distinguish chromids from plasmids. The reason is that many replicons, including pKON1 (95 049 bp) of P. kondratievae, carry very efficient toxin-antitoxin systems, which cause post-segregational elimination of cells deprived of the replicon from bacterial population. Such replicons, which do not carry any essential genes, should be classified as plasmids. In the genome of P. aminophilus JCM 7686, two replicons (out of eight extrachromosomal replicons of this strain) were found to be crucial for the viability or proper growth of the strain. One of them, pAMI5 (294 013 bp), could not be removed from the host cells by incompatibility in any of the tested conditions, even after the elimination of the influence of the pAMI5-encoded toxin-antitoxin system . This result suggests that pAMI5 carries housekeeping genes and its loss is lethal to the cell. The second replicon, pAMI6 (206 582 bp), could be easily removed from the JCM 7686 cells. However, the obtained pAMI6-less strain showed slower growth rate in rich media and was completely unable to grow in minimal media. Thus, pAMI6 encodes genes essential for normal growth of P. aminophilus, and its loss undoubtedly affects the competitiveness of the strain in its natural environment.   pAMI5 and pAMI6 carry numerous genes conserved in the chromosomes of many closely related bacterial species. It was proposed to classify both these replicons as chromids. Based on the differences in their significance for the host cells, pAMI5 was defined as a primary chromid (obligatorily essential), and pAMI6 as a secondary chromid (facultatively essential). Further analyses revealed that the P. aminophilus JCM 7686 chromids determine metabolic capabilities characteristic for this strain, and thus they can be considered as lifestyle-determining replicons. Both chromids carry genes involved in methylotrophy (metabolic capability that allows the use of C1 compounds, e.g. methane, methanol, methylamine, as the sole source of carbon and energy), which is the key feature allowing P. aminophilus to inhabit its natural niche, i.e. soil polluted with N,N-dimethylformamide (C1 compound).