Analiza funkcji kompleksu remodelującego chromatynę SWI/SNF w regulacji ekspresji genów zależnych od giberelin w Arabidopsis thaliana

Gibereliny to niskocząsteczkowe hormony roślinne koordynujące złożone procesy fizjologiczne takie jak: wzrost, rozwój organów, kwitnienie, wykształcenie nasion oraz ich kiełkowanie. Pod wpływem giberelin i z udziałem różnorodnych mechanizmów regulacyjnych ekspresja wielu genów ulega zmianie, wpływając tym samym na fizjologię roślin. Jednym ze wspomnianych mechanizmów jest remodeling chromatyny, zależny od kompleksów typu SWI/SNF. Kompleksy SWI/SNF, dzięki aktywności swych podjednostek ATPazowych, mogą modyfikować stopień kondensacji wybranych obszarów chromatyny. Wpływa to na dostępność tych obszarów dla maszynerii transkrypcyjnej, a w efekcie prowadzi do zmian w poziomie ekspresji genów. Mimo że ogólny schematu funkcjonowania giberelinowej ścieżki sygnałowej jest znany, to jednak nie wszystkie związane z nią procesy molekularne zostały wystarczająco wyjaśnione, a zaangażowane w nie białka zidentyfikowane. Wyjaśnienia wymaga również, jakie geny są regulowane przez kompleksy SWI/SNF w oraz jak wygląda ich regulacja w odpowiedzi na hormon. W ramach niniejszej rozprawy doktorskiej podjęto próbę bliższej charakteryzacji mechanizmu odpowiedzi na gibereliny ze szczególnym uwzględnieniem roli białka BRM, podjednostki katalitycznej kompleksów SWI/SNF u Arabidopsis thaliana. Badania prowadzono w zakresie proteomicznym, jak i transktyptomicznym. Analizy funkcjonalne, przeprowadzone w części białkowej pracy, możliwe były dzięki uzyskaniu specyficznych przeciwciał poliklonalnych, skierowanych przeciwko N-końcowej części BRM. W rezultacie zaobserwowano naturalne wahania poziomu białka BRM, zdolność Arabidopsis do regulacji BRM w przypadku jego nadekspresji oraz zależność poziomu BRM od poziomu endogennych giberelin i represorów ścieżki giberelinowej z grupy DELLA. Dzięki zastosowaniu technik immunoprecypitacji i metod spektrometrii mas zanalizowano kompozycję podjednostkową SWI/SNF. Zidentyfikowano również potencjalne interaktory kompleksów w sytuacji deficytu endogennych giberelin oraz po traktowaniu egzogenną gibereliną i kwasem abscysynowym. W części transkryptomicznej pracy przeprowadzono rozbudowane analizy mikromacierzowe, w wyniku których zaproponowano cztery – zależne od BRM – mechanizmy regulacji genów w odpowiedzi na traktowanie gibereliną.

Gibberellins are low molecular weight plant hormones orchestrating complex physiological processes such as: plant growth and development, flowering, seed formation and germination. Gibberellin stimulus can change multiple genes expression and in result alter plant’s physiology. This process requires various regulatory mechanisms, such as SWI/SNF dependent chromatin remodeling. SWI/SNF chromatin remodeling complexes, with application of their motor (ATPase) subunits, are capable to selectively modify chromatin condensation. In effect, SWI/SNF complexes can change genes accessibility for a transcription machinery and therefore alter their expression. The general mechanism of the gibberellin signaling pathway has been understood, however not all molecular processes and components involved have been identified and elucidated. It’s also unclear which genes are regulated by SWI/SNF in response to the gibberellins and what is the nature of this regulation. This dissertation is an attempt to better characterize the mechanism of response to the gibberellin signal, with a special focus on BRM protein, a catalytic subunit of SWI/SNF in Arabidopsis thaliana. The studies covered functional analyses in scope of proteomics and transcriptomics. Functional proteomic analyses were the effect of successful development of specific polyclonal antibodies directed against the N-terminal part of BRM. In result, natural fluctuations of the BRM protein have been observed. Moreover, Arabidopsis plants have shown to regulate BRM protein level upon BRM overexpression. The analyses also revealed that the BRM protein level depends on the endogenous gibberellin level as well as the DELLA repressors. Further experiments, carried out with application of immunoprecipitation techniques and mass spectrometry methods, allowed for the analysis of SWI/SNF subunit composition and the identification of SWI/SNF potential protein interactors. The SWI/SNF variability was studied under deficiency of endogenous gibberellins but also under stimulation with exogenous gibberellins and abscisic acid. In the transcriptomic part of the work, extensive microarray analyses have been preformed. In result, four mechanisms for the BRM-dependent gene regulation in response to gibberellin signal have been proposed.