The role of MRCK kinases and PPP2R3C phosphatase in the Hedgehog signaling cascade

W złożonej sieci komórkowych szlaków sygnalizacyjnych modyfikacje potranslacyjne (ang. post-translational modifications, PTM) odgrywają kluczową rolę w procesach regulacyjnych, precyzyjnie dostosowując funkcje licznych białek, zwłaszcza czynników transkrypcyjnych wchodzących w skład szlaków sygnalizacyjnych. Pośród wspomnianych szlaków możemy wyróżnić kaskadę sygnalizacyjną Hedgehog (Hh), która odgrywa kluczową rolę zarówno w rozwoju embrionalnym, jak i w utrzymaniu homeostazy dorosłych tkanek. Zakłócenia w tej ścieżce są związane z nieprawidłowościami w rozwoju embrionalnym oraz różnymi typami nowotworów, w tym rakiem jajnika, rakiem podstawnokomórkowym skóry czy rdzeniakiem zarodkowym. W regulacji ścieżki Hh pośredniczą białka Gli, działające jako czynniki transkrypcyjne. Gli1 przede wszystkim pełni funkcję aktywatora transkrypcji, podczas gdy Gli2 i Gli3 pełnią podwójną rolę jako aktywatory i represory. Dynamiczna równowaga między formami aktywatora (GliA) i represora (GliR) białek Gli kształtuje efekt sygnalizacji Hedgehog w komórce. Fosforylacja, katalizowana przez grupę enzymów zwanych kinazami, jest uznana za jedną z kluczowych modyfikacji potranslacyjnych, wpływających na funkcję i aktywność czynników transkrypcyjnych Gli. Najlepiej opisana kinaza białkowa A (PKA) inicjuje fosforylację białek Gli w klastrze P1–6. Dodatkowo, kinaza kazeinowa 1 (CK1) i kinaza glikogenowa syntazy 3-beta (GSK3-β) odgrywają rolę w dalszej modyfikacji aktywności białek Gli, szczególnie pod nieobecność sygnału Hh. Do innych kinaz modulujących odpowiedź Hh zaliczamy kinazy tyrozynowe z rodziny DYRK, kinazy serynowo/treoninowe (LKB1, Akt, CK2, AMPK, ULK3) i członków rodziny kinaz białkowych aktywowanych przez mitogen (MAPK), które wpływają zarówno pozytywnie, jak i negatywnie na aktywność białek Gli. Fosforylacja białek to proces odwracalny, w którym fosfatazy przeciwdziałają działaniu kinaz poprzez usuwanie grup fosforanowych. Fosfataza białkowa 2A (PP2A) defosforyluje różne składniki kaskady sygnalizacji Hedgehog, w tym Smo, Ci/Gli i Kif7. Jednak nasze zrozumienie roli fosfataz i ich podjednostek regulacyjnych w tym procesie jest ograniczone. Niniejsze badania, przedstawione w dwóch pracach doświadczalnych, mają na celu zbadanie regulacji sygnalizacji Hh przez kinazy i fosfatazy. Korzystając z wysokoprzepustowych analiz spektrometrii mas i funkcjonalnych badań przesiewowych opartych na technologii 10 CRISPR/Cas9, wytypowałam nowe kinazy i fosfatazę zaangażowane w regulację ścieżki Hh. Pierwsza z prezentowanych prac opisuje dwie nowe kinazy, MRCKα i MRCKβ, fizycznie oddziałujące z białkami Gli. MRCKα bezpośrednio fosforyluje Gli2 w wielu miejscach, pozytywnie regulując aktywność białek Gli jako czynników transkrypcyjnych w komórkach normalnych i nowotworowych. Inaktywacja MRCKα/β wpływa na lokalizację Gli2 w rzęsce pierwotnej i jądrze komórkowym, zmniejszając wiązanie Gli2 z promotorem genu Gli1. Drugi manuskrypt skupia się na poznaniu roli podjednostki B″gamma fosfatazy PP2A, PPP2R3C, w regulacji sygnalizacji Hedgehog. Wykazałam, że PPP2R3C oddziałuje z białkami Gli, a jej zaburzenie zmniejsza aktywność ścieżki Hedgehog oraz wzrost komórek nowotworowych zależnych od Hh. PPP2R3C przeciwdziała również negatywnemu wpływowi kinazy MEKK1 na ścieżkę sygnalizacji Hedgehog. Podsumowując, moje wyniki ujawniają nowe mechanizmy regulacji białek Gli poprzez fosforylację i defosforylację. W kontekście translacyjnym moje odkrycia identyfikują kinazy MRCK i fosfatazę PPP2R3C jako obiecujące cele terapeutyczne w leczeniu rdzeniaka zarodkowego oraz innych nowotworów związanych ze ścieżką Hedgehog.

In complex cellular signaling networks, post-translational modifications (PTM) play a crucial role in regulatory processes, finely tuning the functions of numerous proteins, especially transcription factors that form parts of several signaling pathways. Among these signaling pathways, the Hedgehog (Hh) signaling cascade holds a key role in both embryonic development and the maintenance of adult tissue homeostasis. Disruptions in this pathway are associated with developmental abnormalities and various types of tumors, including ovarian cancer, basal cell carcinoma, and medulloblastoma. The regulation of the Hh pathway is mediated by Gli proteins, acting as transcription factors. Gli1 primarily functions as a transcriptional activator, while Gli2 and Gli3 have dual roles as both activators and repressors. The dynamic balance between the activator (GliA) and repressor (GliR) forms of Gli proteins significantly shapes the Hedgehog signaling effect in the cell. Phosphorylation, mediated by a group of enzymes known as kinases, is a crucial PTM that influences the function and activity of Gli transcription factors. Among the well-known kinases involved in Gli phosphorylation, Protein kinase A (PKA) stands out, initiating phosphorylation within the P1–6 cluster. Additionally, Casein 1 (CK1) and Glycogen Synthase Kinase 3-beta (GSK3-β) play roles in further modifying Gli activity, particularly in the absence of the Hh signal. Furthermore, other kinases contribute to both positive and negative regulation of Gli protein activity within the Hedgehog pathway. Notable examples include the DYRK family of tyrosine kinases, various serine/threonine kinases such as LKB1, Akt, CK2, AMPK, ULK3, and members of the mitogen-activated protein kinase (MAPK) family. Protein phosphorylation is a reversible process with phosphatases counteracting the action of kinases by removing the phosphate groups. Protein Phosphatase 2A (PP2A) dephosphorylates various components within the Hedgehog signaling cascade, including Smo, Ci/Gli, and Kif7. However, the comprehensive understanding of the role played by phosphatases and their regulatory subunits in this process is limited. This doctoral dissertation, presented in two original articles, aims to explore the regulation of Hh signaling by kinases and phosphatases. Employing data from large-scale mass spectrometry and functional screens, I identified novel kinases and phosphatase involved in Hh pathway regulation. The first of my original works describes two new kinases, MRCKα and MRCKβ, which physically interact with Gli proteins. MRCKα directly phosphorylates Gli2 at multiple sites, positively regulating Gli proteins' activity as transcription factors in normal and cancerous cells. Inactivation of MRCKα/β affects the localization of Gli2 in the primary cilium and the cell nucleus, reducing Gli2 binding to the Gli1 gene promoter. The second work focuses on the discovery of a new role for the B"gamma subunit of the PP2A phosphatase, PPP2R3C, in Hedgehog signaling regulation. I demonstrated that PPP2R3C interacts with Gli proteins, and its disruption decreases Hedgehog pathway activity and growth of Hh-dependent cancer cells. PPP2R3C counteracts the negative impact of MEKK1 kinase on the Hedgehog signaling pathway. In summary, my results reveal novel Gli protein regulation mechanisms through phosphorylation and dephosphorylation. In a translational context, my discoveries identify MRCK kinases and PPP2R3C phosphatase as promising therapeutic targets in the treatment of medulloblastoma and other Hedgehog pathway-associated tumors.