Otrzymywanie peptydów zdolnych do katalizowania reakcji fosfotransferazowych

Fosforany są niezwykle ważną grupą związków dla funkcjonowania organizmów żywych i stanowią niezastępowalną część składową życia. Wchodzą w skład kwasów nukleinowych, błon biologicznych, na nich opiera się komórkowy szlak sygnałowy i system aktywacji substratów w procesach metabolicznych, a ich bezwodniki stanowią uniwersalną walutę energetyczną organizmów żywych. Wszystkie te procesy, są możliwe dzięki jednej bardzo ważnej właściwości fosforanów, jaką jest ich stabilność. Reszty fosforanowe są wyjątkowo odporne na hydrolizę, dlatego też ich przemiany wymagają udziału specyficznych katalizatorów enzymatycznych. Enzymy, pomimo wielu zalet, mają także swoje ograniczenia, takie jak wielkość cząsteczek i ich stabilność, przez które problematycznym staje się ich zastosowanie w przemyśle lub medycynie. Alternatywnym podejściem jest opracowanie „minimalnych” enzymów — małocząsteczkowych fragmentów właściwych enzymów, naśladujących katalizę enzymatyczną na podstawowym poziomie jej działania. Przykładem takiego katalizatora jest serylo-histydyna, będąca minimalnym odpowiednikiem hydrolaz serynowych, których kataliza oparta jest na indukowanej polaryzacją cząsteczki silną nukleofilowością grupy hydroksylowej seryny. Jednak minimalne enzymy mogące przenosić grupy fosforanowe przy wykorzystaniu energii pochodzącej z hydrolizy wiązania pirofosforanowego do tej pory nie zostały opracowane. Otrzymanie właśnie takich katalizatorów, opartych na strukturze peptydowej było celem niniejszej pracy. Pierwszą próbą opracowania małocząsteczkowego katalizatora reakcji przeniesienia grupy fosforanowej było zaprojektowanie peptydu, który mógłby naśladować działanie syntetazy. Syntetazy to enzymy, które dzięki energii pochodzącej z hydrolizy wiązania pirofosforanowego są w stanie aktywować poprzez fosforylację jeden substrat, a następnie podstawiając grupę fosforanową przez zaktywowany jako nukleofil drugi substrat, dokonać kondensacji obu substratów. Do opracowania sekwencji takiego peptydu zastosowałem modelowanie molekularne in-silico opierając się na znanych miejscach aktywnych enzymów z rodziny syntetaz oraz znajomości ich mechanizmu działania. Następnie przeprowadziłem syntezę peptydów i poddałem je badaniom katalitycznym. Okazało się, że jeden z zaprojektowanych peptydów wykazywał podobny do syntetaz mechanizm reakcji, przeprowadzając reakcję, w której był wykorzystywany substrat ze środowiska. Niestety, okazało się, że zamiast grupy karboksylowej substratu znajdującego się w środowisku katalizator preferował grupę karboksylową znajdującą się w cząsteczce katalizatora. Powstały w ten sposób kondensat katalizator-substrat stawał się nieaktywny katalitycznie. Ponieważ reakcja syntetazowa jest reakcją dwustopniową, przez co ciężko ją kontrolować w obrębie wyznaczonych założeń, w drugim podejściu postanowiłem otrzymać peptyd katalityczny, który miałby właściwości pirofosfatazy. Dodatkowym celem było opracowania takiego katalizatora, który oprócz hydrolizy pirofosforanu, miałby zdolność rozpuszczania kryształów dwuwodnego pirofosforanu wapnia. Taki katalizator mógłby znaleźć zastosowania w medycynie jako potencjalny lek przeciwko dnie rzekomej, w której czynnikiem etiologicznym jest odkładanie się w stawach kryształów pirofosforanu wapnia. Do uzyskania tego celu posłużyłem się techniką ewolucji kierunkowej znanej jako prezentacja fagowa (ang.: phage display). Biblioteki bakteriofagów prezentujących losowe sekwencje peptydowe przesiałem względem dwóch kluczowych właściwości: 1) powinowactwa do odpornego na hydrolizę kwasu alendronowego (będącego analogiem stanu przejściowego pirofosforanu); oraz 2) hydrolizy kryształów pirofosforanu wapnia. W ten sposób wyselekcjonowałem peptydy do syntezy, a po ich syntezie ponownie sprawdziłem właściwości katalityczne. Jeden z peptydów okazał się posiadać szukane właściwości, tzn. przyspieszał hydrolizę pirofosforanu w próbach, jednak jego aktywność okazała się być hamowana przez powstające w reakcji jony wapnia.

Phosphates are an indispensable part of life. They form nucleic acids and biological membranes. The cell signaling pathway and the substrate activation system in metabolic processes are based on phosphorylation. And phosphate homoanhydrides are the universal energy currency of living organisms. All processes that use phosphate groups are possible due to one important property of these compounds — stability. Phosphate residues are extremely resistant to hydrolysis, therefore their transformations are inextricably linked with the presence of specific enzyme catalysts. Enzymes, despite their usefulness, also have their limitations, such as size and stability, which often make their use in industry or medicine problematic. An alternative approach consists of minimal enzymes — molecules made of biopolymers that mimic enzymatic activity at a minimal level of their properties. An example of such a catalyst is serine-histidine, which is a minimal analogue of serine hydrolases — catalysis of which is based on the polarity-induced strong nucleophilicity of the serine hydroxyl group. Until now, however, minimal enzymes capable of transferring phosphate groups, using energy derived from the hydrolysis of the pyrophosphate linkage, have not been known. This work aimed to obtain peptide-based molecules able to perform such catalysis. The first attempt was to obtain a peptide that could mimic the action of a synthetase. Synthetases are enzymes that, due to the hydrolysis of the pyrophosphate bond, are able to activate one substrate by phosphorylation, and subsequently by substituting the phosphate group with the second substrate activated as a nucleophile, perform a condensation of both molecules. To obtain such a peptide, I used in-silico molecular modeling based on the known active sites of enzymes from the synthetase family and the knowledge of their mechanism of action. One of the designed peptides showed a synthetase-like catalytic mechanism and performed the reaction in which it was forming a peptide bond. Unfortunately, instead of using a substrate from the environment, it turned out that the catalyst preferred the group located on its own molecule. The resulting catalyst-substrate condensate became catalytically inactive. The second attempt was to obtain a peptide having pyrophosphatase properties. As the intention was to use this catalyst in the future as a therapeutic against crystals of dihydrate calcium pyrophosphate — the etiological factor of pseudogout, the additional requirement was the ability to dissolve these crystals in order to hydrolyze the pyrophosphate contained therein. To achieve this goal, I have used a directed evolution technique, known as phage display. I have screened through a library of bacteriophages displaying random peptide sequences, in search of two key properties: 1) affinity toward a hydrolysis-resistant alendronic acid and 2) hydrolysis of calcium pyrophosphate crystals. According to the best performing bacteriophages’ sequences, peptides were selected for synthesis and their catalytic abilities were tested again. One of them showed desired properties, but its activity turned out to be inhibited by the calcium ions, formed during the dissolution of crystals. Both attempts to obtain catalytic peptides were partially successful, as the desired catalytic properties were achieved. However, for various reasons, these peptides cannot be used for the originally intended purposes, as the obtained molecules require further work to be able to fulfill their target functions.