Praca doktorska
Miniatura
Pliki
1400-DR-BIOL-154299.pdf6.75 MB
Licencja
FairUseKorzystanie z tego materiału możliwe jest zgodnie z właściwymi przepisami o dozwolonym użytku lub o innych wyjątkach przewidzianych w przepisach prawa. Korzystanie w szerszym zakresie wymaga uzyskania zgody uprawnionego.
 

Analiza ludzkiego mitochondrialnego DNA w chorobach wieloczynnikowych i mitochondrialnych metodami sekwencjonowania wysokoprzepustowego

Uproszczony widok
dc.abstract.enHuman mitochondrial DNA (mtDNA) contains 37 genes that encode 13 polypeptides of the oxidative phosphorylation system, 22 types of tRNA and 2 types of rRNA. Pathogenic variants of mtDNA can cause mitochondrial diseases which are disorders resulting from respiratory chain dysfunction. It is also suggested that mtDNA variants are involved in the predisposition to common multifactorial diseases. The aim of this PhD thesis was to develop a method for analysis of whole mtDNA by high-throughput sequencing and to determine the contribution of mtDNA variation in the development of four common diseases with complex etiology, normal tension glaucoma (NTG), obesity, type 2 diabetes and atherosclerosis, as well as mitochondrial diseases in Polish patients. In order to enrich mtDNA before sequencing, a method for amplification of the entire mtDNA based on long PCR was developed. It has been shown that it also allows for verification of the presence of large mtDNA deletions. The developed method of whole mtDNA analysis using high-throughput sequencing on Illumina's MiSeq platform enables simultaneous detection of variants throughout the entire mtDNA sequence and determination of their even very low heteroplasmy. This method has been shown to be specific, reliable, accurate, sensitive and reproducible. Analysis of the mtDNA haplogroup frequency showed that haplogroup U5 and five genetic variants that determine it are protective factors in the development of obesity, while the haplogroup JT and three variants that determine it increase the risk of obesity. In addition, haplogroup H1 was found to increase the risk of NTG. Among other identified single variants of mtDNA, m.143G> A and m.152T> C were observed to associate with the risk of obesity and m.310T> C and m.12705C> T with NTG. Analysis of the frequency of rare variants in various regions of mtDNA has shown that they may contribute to the development of obesity (MT-CO3) and NTG (MT-ND6). The increase of mutational load of potentially harmful nonsynonymous variants, probably acting in synergy and often being common variants associated with mtDNA haplogroups, is associated with the increased risk of atherosclerosis. In the studied groups of patients no significant increase in mtDNA variation was found to associate with multifactorial diseases. It has also been demonstrated that confirmed pathogenic point mutations as well as large deletions of mtDNA do not contribute to the development of the studied diseases. Heteroplasmy of mtDNA is common, both among patients with multifactorial diseases and healthy people, but most likely also does not contribute to the development of the studied diseases. The mtDNA analysis confirmed the presence of pathogenic variants in 22% of the subjects with clinical diagnosis or suspicion of mitochondrial disease. Large deletions were the cause of the disease in 18% of cases, whereas pathogenic point mutations in 4%. Three other potentially pathogenic point variants of mtDNA were also identified (m.5698G> A, m.13052G> A and m.14686G> T) and they are most likely the cause of the disease in the studied subjects. The developed method of high-throughput sequencing is an excellent tool for studying the variation of the mitochondrial genome in humans. The results presented in this dissertation indicate a significant contribution of mtDNA variation to the development of three out of four common multifactorial diseases in the Polish population. In the group of patients with type 2 diabetes, trends with borderline statistical significance were detected, which need further verification. Identified risk and protection factors may be used in the future as predictors in determining susceptibility to the development of the studied diseases.
dc.abstract.plMitochondrialny DNA (mtDNA) człowieka zawiera 37 genów, które kodują 13 białek systemu fosforylacji oksydacyjnej, 22 rodzaje tRNA oraz 2 rodzaje rRNA. Patogenne warianty mtDNA mogą prowadzić do rozwoju tzw. chorób mitochondrialnych, schorzeń wynikających z dysfunkcji łańcucha oddechowego. Sugeruje się również udział wariantów mtDNA w predyspozycji do rozwoju powszechnych chorób wieloczynnikowych. Celem niniejszej pracy było opracowanie metody analizy pełnej sekwencji mtDNA przy użyciu sekwencjonowania wysokoprzepustowego oraz wykorzystanie jej do określenia udziału zmienności mtDNA w rozwoju czterech powszechnych chorób o złożonym podłożu, jaskry niskiego ciśnienia (JNC), otyłości, cukrzycy typu 2 i miażdżycy, oraz chorób mitochondrialnych u polskich pacjentów. W celu wzbogacania mtDNA przed sekwencjonowaniem opracowano metodę namnażania całego mtDNA opartą na reakcji długiego PCR. Wykazano, że umożliwia ona również weryfikację obecności rozległych delecji mtDNA. Opracowana metoda analizy całej sekwencji mtDNA z użyciem sekwencjonowania wysokoprzepustowego na platformie MiSeq firmy Illumina umożliwia jednoczesną detekcję wariantów w całej sekwencji mtDNA i określenie nawet niskiej heteroplazmii. Wykazano, że metoda ta jest specyficzna, wiarygodna, dokładna, czuła i powtarzalna. Analiza częstości haplogrup mtDNA wykazała, że haplogrupa U5 oraz pięć określających ją wariantów genetycznych pełnią rolę czynnika protekcyjnego w rozwoju otyłości, podczas gdy klaster haplogrup JT oraz trzy określające go warianty zwiększają ryzyko tej choroby. Ponadto, haplogrupa H1 sprzyja rozwojowi JNC. Wśród innych zidentyfikowanych pojedynczych wariantów mtDNA zmiany m.143G>A i m.152T>C wykazywały asocjację z ryzykiem rozwoju otyłości, a m.310T>C i m.12705C>T JNC. Analiza częstości rzadkich wariantów w różnych regionach mtDNA wykazała, że mogą one przyczyniać się do rozwoju otyłości (MT-CO3) i JNC (MT-ND6). Wzrost obciążenia mutacyjnego potencjalnie szkodliwymi wariantami niesynonimicznym, prawdopodobnie działającymi synergistycznie i będącymi często powszechnymi wariantami związanymi z haplogrupami mtDNA wiąże się ze wzrostem ryzyka rozwoju miażdżycy. W badanych grupach pacjentów nie stwierdzono by znaczący wzrost zmienności mtDNA towarzyszył chorobom wieloczynnikowym. Wykazano także, że potwierdzone, patogenne warianty punktowe, jak również rozległe delecje mtDNA, nie mają znaczącego udziału w rozwoju badanych chorób. Heteroplazmia mtDNA występuje powszechnie, zarówno wśród osób z chorobami wieloczynnikowymi, jak i wśród osób zdrowych, jednak najprawdopodobniej również nie ma ona istotnego udziału w rozwoju badanych chorób. Analiza mtDNA pozwoliła na potwierdzenie obecności patogennych wariantów u 22% osób z klinicznym rozpoznaniem lub podejrzeniem choroby mitochondrialnej. Przyczynę choroby stanowiły rozległe delecje (18%) lub patogenne warianty punktowe (4%). Zidentyfikowano również trzy inne, potencjalnie patogenne, punktowe warianty mtDNA (m.5698G>A, m.13052G>A i m.14686G>T), które z dużym prawdopodobieństwem stanowią przyczynę choroby badanych osób. Opracowana metoda sekwencjonowania wysokoprzepustowego jest doskonałym narzędziem do badań nad zmiennością genomu mitochondrialnego u ludzi. Przedstawione w niniejszej rozprawie wyniki badań wskazują na istotny udział zmienności mtDNA w rozwoju trzech z czterech powszechnych chorób wieloczynnikowych w populacji polskiej. W grupie chorych na cukrzycę typu 2 wykryto trendy na pograniczu istotności statystycznej, które wymagają dalszej weryfikacji. Zidentyfikowane czynniki ryzyka i protekcyjne mogą w przyszłości posłużyć jako wartości predykcyjne przy określaniu podatności na rozwój badanych chorób.
dc.affiliation.departmentWydział Biologii
dc.contributor.authorPiotrowska-Nowak, Agnieszka
dc.date.accessioned2019-05-09T08:05:51Z
dc.date.available2019-05-09T08:05:51Z
dc.date.defence2019-05-20
dc.date.issued2019-05-09
dc.description.promoterTońska, Katarzyna
dc.identifier.urihttps://repozytorium.uw.edu.pl//handle/item/3321
dc.language.isopl
dc.rightsFairUse
dc.subject.enmitochondrial diseases
dc.subject.enatherosclerosis
dc.subject.entype 2 diabetes
dc.subject.enobesity
dc.subject.ennormal tension glaucoma
dc.subject.encommon multifactorial diseases
dc.subject.enhigh-throughput sequencing
dc.subject.engenetic variation
dc.subject.enmitochondrial DNA
dc.subject.plchoroby mitochondrialne
dc.subject.plmiażdżyca
dc.subject.plcukrzyca typu 2
dc.subject.plotyłość
dc.subject.pljaskra niskiego ciśnienia
dc.subject.plpowszechne choroby wieloczynnikowe
dc.subject.plsekwencjonowanie wysokoprzepustowe
dc.subject.plzmienność genetyczna
dc.subject.plmitochondrialny DNA
dc.titleAnaliza ludzkiego mitochondrialnego DNA w chorobach wieloczynnikowych i mitochondrialnych metodami sekwencjonowania wysokoprzepustowego
dc.title.alternativeAnalysis of human mitochondrial DNA in multifactorial and mitochondrial diseases by high-throughput sequencing methods
dc.typeDoctoralThesis
dspace.entity.typePublication