Poszukiwanie nowych strategii przeciwbakteryjnych opartych na kwasach nukleinowych i peptydomimetykach

Oporność bakterii na antybiotyki stanowi coraz bardziej rozpowszechniający się problem współczesnego świata. Pojawiają się kolejne szczepy wielolekooporne, które skutecznie hamują działania dotychczasowych substancji leczniczych. Zapadalność na infekcje i liczba zgonów nimi spowodowana wciąż rośnie. W związku z tym, zachodzi ogromna potrzeba wprowadzenia nowych, skutecznych terapii przeciwbakteryjnych. Celem projektu doktorskiego było zbadanie nowych potencjalnych strategii przeciwbakteryjnych wykorzystujących kwasy nukleinowe i peptydomimetyki. W rozprawie przedstawiono trzy podejścia, które mogą doprowadzić do zahamowania wzrostu bakterii lub dotyczą transportu cząsteczek do wnętrza komórek mikroorganizmów. Strategia pierwsza wykorzystuje rybozymy - aktywne katalitycznie enzymy RNA. W reakcji transestryfikacji rybozymy hydrolizują wiązania fosfodiestrowe w specyficznych miejscach w sekwencji innych cząsteczek RNA. Zaprojektowano rybozym hammerhead oddziałujący z informacyjnym RNA (mRNA) kodującym sekwencję białka przenoszącego grupy acylowe (ACP). ACP będące kofaktorem w biosyntezie kwasów tłuszczowych jest niezbędne bakterii do życia. Hydroliza mRNA kodującego sekwencję białka ACP we właściwym miejscu powinna doprowadzać do zahamowania wzrostu bakterii. Zaprojektowano rybozymy o różnej długości ramion i in vitro sprawdzono stabilność ich kompleksów oraz hydrolizę fragmentu mRNA jako substratu. Następnie sekwencje rybozymów zostały umieszczone na plazmidzie i wprowadzone do komórek E. coli, w których zaobserwowano działanie katalityczne prowadzące do inhibicji wzrostu. Ponadto, wykazano synergię jednego z rybozymów z antybiotykiem - tetracykliną. Zaprojektowanie i sprawdzenie rybozymu jako enzymu potencjalnie hydrolizującego mRNA w komórkach otwiera drogę do badania katalitycznych RNA jako związków przeciwbakteryjnych lub jako związków pomocniczych. W strategii drugiej wykorzystywano aktywne błonowo peptydy. Udowodniono, że stabilizacja ich struktury drugorzędowej poprawia ich oddziaływanie z błoną bakterii i zwiększa ich potencjał przeciwbakteryjny. Peptydy, m. in. anoplina, o słabych własnościach przeciwbakteryjnych zostały zmodyfikowane za pomocą specjalnych łańcuchów węglowodorowych. Umożliwiło to stabilizację ich helikalnej struktury aktywnej błonowo, dzięki czemu mogły efektywniej oddziaływać z błonami komórkowymi niż peptydy niezmodyfikowane. Skuteczność poszczególnych peptydomimetyków różniła się w zależności od szczepu bakterii. Szczepy Gram-ujemne wykazały większą wrażliwość na działanie peptydomimetyków bardziej hydrofilowych, zaś Gram-dodatnie – pochodnych hydrofobowych. Wyniki pokazały, że chemiczna stabilizacja aktywnej błonowo struktury drugorzędowej naturalnych peptydów wielokrotnie zwiększa ich aktywność przeciwbakteryjną, często nie powodując jednocześnie hemolityczności. Trzecia strategia polegała na wykorzystaniu witaminy B12 (cyjanokobalaminy) jako nośnika peptydowego kwasu nukleinowego (PNA) do bakterii E. coli i określenia ścieżki tego transportu. PNA to syntetyczny analog DNA, który może działać jako antysensowny oligonukleotyd. Sekwencje PNA mogą zostać zaprojektowane tak, aby wiązały się komplementarnie i blokowały mRNA kluczowe dla życia bakterii. Potrzebują jednak transporterów, gdyż wolne PNA nie jest pobierane przez komórki. Określono szlak transportu koniugatów witaminy B12-PNA do bakterii E. coli. Okazuje się, że PNA związane z witaminą B12 jest transportowane poprzez te same receptory w błonie zewnętrznej i wewnętrznej co wolna witamina B12. Otwiera to drogę do użycia tego szlaku transportu przez inne cząsteczki PNA kowalencyjnie podłączone do witaminy B12.

Bacterial resistance to antibiotics is becoming an increasingly widespread problem in the modern world. New multi-drug-resistant strains are emerging, effectively hindering the actions of existing therapeutic agents. The incidence of infections and the number of deaths caused by them continue to rise. Consequently, there is an immense need for the introduction of new, effective antibacterial therapies. The aim of the doctoral project was to investigate new potential antibacterial strategies using nucleic acids and peptidomimetics. The dissertation presents three approaches that may lead to the inhibition of bacterial growth or involve the transport of molecules into the interior of microbial cells. The first strategy uses ribozymes - catalytically active RNA enzymes. Ribozymes can hydrolyze phosphodiester bonds at specific sites in the sequence of other RNA molecules. A hammerhead ribozyme was modified to interact with messenger RNA (mRNA) encoding the sequence of acyl carrier protein (ACP). ACP, which is a cofactor in fatty acid biosynthesis, is essential for bacteria to sustain life. Hydrolysis of the mRNA encoding the ACP sequence at the appropriate site should lead to inhibition of bacterial growth. Ribozymes of different arm lengths were designed and the stability of their complexes with an mRNA fragment as a substrate and its hydrolysis were tested in vitro. Subsequently, the ribozyme sequences were incorporated on a plasmid and introduced into E. coli cells, where the ribozyme catalytic activity leading to growth inhibition was observed. Additionally, synergy between one of the ribozymes and the antibiotic tetracycline was demonstrated. The design and testing of ribozymes as potentially mRNA-hydrolyzing enzymes in cells pave the way for the investigation of catalytic RNAs as antibacterial compounds or adjuncts. The second strategy involved membrane-active peptides. It was demonstrated that stabilizing their secondary structure improves their interaction with bacterial membranes and enhances their antibacterial potential. Peptides, including anoplin, with weak antibacterial properties, were modified using hydrocarbon stapling technique. This stapling stabilized their helical membrane-active structure, enabling them to interact more effectively with cell membranes than unmodified peptides. The effectiveness of such peptidomimetics varied depending on the bacterial strain. Gram-negative strains showed greater sensitivity to the action of more hydrophilic peptidomimetics, while Gram-positive strains showed sensitivity to hydrophobic derivatives. The results showed that chemical stabilization of the membrane-active structure of natural peptides significantly increased their antibacterial activity, often without causing hemolysis. The third strategy involved using vitamin B12 (cyanocobalamin) as a carrier of peptide nucleic acid (PNA) to E. coli bacteria and determining the pathway of this transport. PNA is a synthetic DNA analog that can act as an antisense oligonucleotide. PNA sequences can be designed to bind complementarily and block mRNA essential for bacterial life. However, they need transporters, as free PNA is not taken up by cells. The transport pathway of vitamin B12-PNA conjugates to E. coli bacteria was determined. It turned out that PNA bound to vitamin B12 is transported through the same receptors in the outer and inner membranes as free vitamin B12. This opens the way for the use of this transport pathway by other PNA molecules covalently attached to vitamin B12.