Investigation of the physiological role of TMCC2 in inner ear sensory hair cells and the erythropoietic system using a novel knockout mouse line

Badania wykorzystujące genetycznie zmodyfikowane modele zwierzęce okazały się niezbędne w dążeniu do wszechstronnego zrozumienia genetycznych i molekularnych podstaw życia i chorób. Myszy są szczególnie użytecznym organizmem modelowym ponieważ potrafimy stosunkowo łatwo modyfikować ich geny a stopień ich genetycznego podobieństwa do ludzi jest wystarczający aby móc wyciągać wnioski istotne dla zrozumienia fizjologii człowieka. Pomimo ciągłych wspólnych dążeń laboratoriów i międzynarodowych konsorcjów oraz znacznego postępu, wiele genów nie zostało jeszcze dezaktywowanych a zakres przebadania fenotypu istniejących szczepów nokautowych jest często ograniczony. Stwarza to szansę na odkrycie nowych funkcji genów i kodowanych przez nie białek oraz ich potencjalnego związku z chorobami człowieka. Przyjmując podejście oparte na weryfikacji roli genu o potencjalnym związku z rozwojem konkretnych zaburzeń genetycznych skupiłam sie na genie Tmcc2 (ang. transmembrane and coiled-coil domain 2), który koduje produkt należący do małej, słabo zbadanej rodziny białek o przewidywanej roli w wewnątrzkomórkowym transporcie pęcherzykowym i ekspresji wskazującej na możliwą funkcję w uchu wewnętrznym, mózgu i układzie krwiotwórczym. Przeanalizowałam fenotyp wytworzonej w tym celu linii nokautów mysich, w której genomie znajduje się delecja inaktywująca gen Tmcc2. Wbrew przewidywaniom odkryłam, że białko TMCC2 nie jest niezbędne do rozwoju i utrzymania zmysłowych komórek włoskowatych ucha wewnętrznego. Zarówno wewnętrzne jak i zewnętrzne komórki rzęsate są spolaryzowane i normalnie rozmieszczone w organie Cortiego. Ich wiązki rzęsek są prawidłowo zorganizowane. Wewnątrzkomórkowa lokalizacja takich ważnych dla funkcjonowania komórek rzęsatych białek jak kadheryna 23 (CDH23), miozyna 6 (MYO6) i miozyna 7a (MYO7A). Zachowana jest też asymetria rozmieszczenia białek EPS8 i EPS8L2 między rzęskami dłuższych i krótszych rzędów a myszy nokautowe reagują na dźwięk. Białko TMCC2 okazało się za to niezbędne dla normalnego przebiegu erytropoezy. Wkrótce po urodzeniu u osesków nokautów rozwija się poważna niedokrwistość przypominająca grupę wrodzonych niedokrwistości dyserytropoetycznych (ang. CDA). Oseski nokautów są wyraźnie bledsze i mniejsze niż ich heterozygotyczne rodzeństwo, mają znacznie obniżoną liczbę czerwonych krwinek, makrocytozę i istotnie podwyższoną liczbę jądrzastych czerwonych krwinek. Zaskakująca jest obecność w ich krwi wielojądrzastych czerwonych krwinek zawierających nawet 12 jąder komórkowych. Wtręty cytoplazmatyczne w jądrze i charakterystyczne podwójne błony komórkowe są widoczne w jądrzastych erytrocytach z myszy Tmcc2-/- oglądanych pod transmisyjnym mikroskopem elektronowym. Względna zawartość CD71+TER119+ prekursorów czerwonych krwinek (CECs) we krwi, szpiku kostnym i śledzionie nokautów jest porównywalna do tej w heterozygotach, ale udział prekursorów i erytrocytów, które skutecznie utraciły jądro komórkowe jest znacznie niższy u nokautów. Co ciekawe, dorosłe nokauty Tmcc2 mają nieznacznie podniesioną liczbę erytrocytów i nie przejawiają makrocytozy. Taka zmiana fenotypu może być spowodowana erytropoezą pozaszpikową ponieważ nawet u dorosłych nokautów sam przebieg erytropoezy jest wciąż zaburzony, na co wskazuje znaczna różnica względnej zawartości precursorów erytrocytów na różnych stadiach dojrzewania zaobserwowana w szpiku kostnym, która wskazuje na wstępowanie zaburzenia dojrzewania tych komórek na etapie przejścia od erytroblastów wielobarwliwych do kwasochłonnych. Na podstawie zaobserwowanego fenotypu myszy nokautowych pod względem genu Tmcc2 proponuję rozważenie możliwego związku ortologicznego genu ludzkiego (TMCC2) z wrodzoną niedokrwistością dyserytropoetyczną. Chociaż nie można jednoznacznie przewidzieć jaki dokładnie typ CDA może być wywołany przez wciąż nieodkryte mutacje TMCC2, to fenotyp myszy nokautowych ma komórkowe i ultrastrukturalne cechy przypominające CDA typu 2, 3 i 4 bardziej niż typ 1. Ponieważ zaburzenia erytropoezy są jedynym wyraźnym fenotypem zaobserwowanym w myszach linii Tmcc2-/- , należy poddać w wątpliwość często wyrażane w literaturze oczekiwanie, że u kręgowców białko TMCC2 swoje najważniejsze funkcje spełnia w mózgu.

Genetically modified animal models have proven to be indispensable for progress towards the comprehensive understanding of the genetic and the molecular basis of life and of disease. Mice are a particularly useful model organism due to the relative feasibility of gene manipulation and the degree of their genetic proximity to humans is sufficient to draw conclusions meaningful in the context of human physiology. Despite continuous concerted effort of laboratories and international consortia and tremendous progress, many genes have not been inactivated yet and the phenotypic characterization of the existing knockout strains is often limited. This creates an opportunity for discovery of new functions of genes, the proteins they code and their potential link to human disease. I took a candidate gene approach and focused on the transmembrane and coiled-coil domain 2 (Tmcc2) gene that encodes a product belonging to a small, poorly characterized family of proteins with a predicted role in intracellular vesicular transport and an expression pattern suggesting a function in the inner ear, the brain and the hematopoietic system. I analyzed the phenotype of a newly generated knockout mouse line that carries an inactivating deletion in the Tmcc2 gene. Contrary to the initial expectation, I found that TMCC2 is not required for the development and maintenance of the inner ear sensory hair cells. Inner and outer hair cells are polarized and positioned normally within the organ of Corti. Their hair bundles are properly organized. Subcellular localization of such important hair cell proteins as cadherin 23 (CDH23), myosin 6 (Myo6), and myosin 7a (Myo7a) appears to be normal. The asymmetric distribution of EPS8 and EPS8L2 between the longer and the shorter stereocilia is also preserved and the knockouts react to sound. Instead, TMCC2 turns out to be indispensable for normal erythropoiesis. The knockout pups develop severe anemia that closely resembles a group of congenital dyserythropoietic anemias (CDAs). Visibly paler and smaller than their heterozygous littermates, knockout neonates have drastically reduced red blood cell (RBC) count, macrocytosis and a significantly elevated fraction of nucleated RBCs (nRBCs). Strikingly, multinucleated RBCs with up to 12 nuclei are present in their blood. Intrusions of cytoplasm into the nucleus and characteristic double membranes are evident in the Tmcc2-/- nRBCs analyzed under the transmission electron microscope. The relative content of CD71+TER119+ erythropoietic precursors (CECs) in the blood, the bone marrow and the spleen of the knockout mice is comparable to that of the heterozygotes but the fractions of enucleated precursors and erythrocytes are markedly reduced. Interestingly, adult Tmcc2 knockouts have a slightly elevated RBC count and no macrocytosis. Such change in phenotype is likely a consequence of extramedullary compensation as even in adult knockouts erythropoiesis remains abnormal, with a severe shift in the relative content of different stage erythroid precursors in the bone marrow that indicates a defect of maturation at the transition from the polychromatic to the orthochromatic stage. Based on the phenotype observed in the Tmcc2 knockout mice, I propose that the human ortholog (TMCC2) is a candidate CDA causative gene. While it is not possible to unequivocally predict which type of CDA would be caused by the so far unidentified TMCC2 mutations, the phenotype of the knockout mice has the cellular and ultrastructural characteristics that resemble CDA type 2, 3 and 4 rather than type 1. Additionally, the fact that the impairment of erythropoiesis is the only readily noticeable phenotype of the Tmcc2-/- mice challenges the often expressed notion that the main role of the TMCC2 protein in vertebrates is in the brain.