Białko BID z kasetą TAT, jako czynnik uwrażliwiający komórki nowotworowe na leki przeciwnowotworowe

Jedną z głównych przyczyn zgonów, zarówno w Polsce jak i na świecie, są nowotwory złośliwe. Problemem jest nie tylko stosunkowo wysoka zapadalność na choroby nowotworowe, ale także trudności terapeutyczne, wynikające m.in. z często obserwowanej oporności komórek nowotworowych na dostępne metody leczenia, w tym na leki przeciwnowotworowe. Komórki nowotworowe wykazują oporność na wiele leków cytostatycznych, zwykle na skutek silnej supresji apoptozy. Powszechnym źródłem supresji apoptozy jest spadek tzw. „funkcjonalnego poziomu” białek apoptotycznych, tzn. obniżenie efektywnego stężenia tych białek poniżej krytycznego minimum, niezbędnego dla uruchomienia apoptozy. Głównymi przyczynami takiego spadku są: (i) obniżenie ekspresji białek apoptotycznych; (ii) zwiększenie poziomu białkowych inhibitorów apoptozy, które dezaktywują białka apoptotyczne, oraz (iii) fosforylacja białek apoptotycznych, która uniemożliwia przekazywanie sygnału i ostatecznie zapobiega apoptozie w komórkach nowotworowych. Celem prezentowanej rozprawy doktorskiej było znalezienie sposobu zniesienia supresji apoptozy w komórkach nowotworowych i uwrażliwienie ich na działanie znanych leków przeciwnowotworowych. Uzyskane wyniki koncentrują się wokół dwóch głównych nurtów badań. W pierwszym podejściu wykazano, że przeciwdziałanie supresji apoptozy poprzez stosowanie inhibitorów kinazy białkowej CK2, podejrzewanej o dezaktywującą fosforylację białek apoptotycznych, obarczone jest ryzykiem. Jest to konsekwencją plejotropowych skutków wyeliminowania aktywności kinazy CK2 w komórkach nowotworowych. Co więcej, efekt działania inhibitora ściśle zależy od sekwencji jego podania w kombinacji z lekami przeciwnowotworowymi. Drugie podejście polegało na wprowadzeniu do wnętrza komórek nowotworowych rekombinowanego białka BID w fuzji z peptydem penetrującym komórki TAT, umożliwiającym swobodne przenikanie białka przez błonę komórkową (fuzyjne białko TAT-BID). Podejście to pozwoliło na dokonanie następujących obserwacji: 1. Białko TAT-BID wnika do komórek w sposób zależny od stężenia, czasu inkubacji oraz typu komórek nowotworowych, co pozwala na dostarczanie komórkom jego kontrolowanych ilości. 2. Białko TAT-BID samo nie indukuje apoptozy w komórkach nowotworowych i charakteryzuje się bardzo niską cytotoksycznością. 3. Białko TAT-BID uczula pewne linie komórek nowotworowych na działanie znanych leków przeciwnowotworowych, nawet jeśli wyjściowo były one na nie oporne, tym samym umożliwia obniżenie dawek stosowanych leków. 4. Dla niektórych linii komórkowych (PC3) i pewnych leków (doksorubicyna) ilość funkcjonalnego białka BID w komórce jest krytyczna dla indukcji apoptozy. 5. Dostarczone białko TAT-BID jest zaangażowane w komórkach PC3 w ścieżkę mitochondrialną szlaku indukcji apoptozy. 6. Fosforylacja białka BID przez kinazę CK2 nie jest mechanizmem odpowiedzialnym za wywołanie supresji apoptozy w komórkach badanych linii. Niniejsza praca doktorska posiada zarówno znaczenie podstawowe, jak i aplikacyjne. Z jednej strony umożliwia weryfikację mechanizmu apoptozy w niektórych komórkach nowotworowych (PC3). Z drugiej zaś pokazuje zdolność białka TAT-BID do uczulania niektórych linii komórek nowotworowych na leki przeciwnowotworowe, co stwarza potencjalną możliwość terapeutycznego wykorzystania tego białka, np. w stosunku do nowotworów, z których wyprowadzono komórki linii PC3, A549 i HeLa. W trakcie wykonywania prezentowanego projektu doktorskiego uzyskałam finansowanie ze środków Uniwersytetu Warszawskiego w postaci 3 grantów BW, którymi kierowałam (BW 501/86-1000030, BW 501/86-102341, DSM 501-86-104913). Otrzymałam także środki pochodzące z Projektu „Doktoraty dla Mazowsza II”. Wyniki stanowiące niniejszą rozprawę doktorską zostały opublikowane jako 3 oryginalne prace naukowe w czasopismach z listy filadelfijskiej (jedna praca w BMC Cancer, dwie prace w Oncology Reports), a także były prezentowane na 4 zjazdach międzynarodowych. Wyniki te wchodzą także w skład dwóch zgłoszeń patentowych (polskiego nr P.406626 i międzynarodowego nr PCT/IB2014/067117). Prezentowane jako wynalazek, wyniki zostały nagrodzone srebrnym medalem na międzynarodowych targach wynalazków „Ideas-Inventions-New Products” iENA 2014 w Norymberdze. Cancer is one of the main causes of death, both in Poland as well as in the world. The relatively high morbidity of cancer diseases is not the only problem faced by clinicians but also therapeutic difficulties, resulting from comparatively frequently observed resistance of cancer cells to available cancer treatments, including anticancer drugs. Cancer cells are resistant for many cytostatic drugs, mainly due to a strong suppression of apoptosis. A common reason for the suppression of apoptosis is decrease of the “functional dose” of proapoptotic proteins below the critical minimum which is essential to launch apoptosis. The main reasons of the decrease are: (i) lowered expression of proapoptotic proteins; (ii) increased level of inhibitors of apoptotic proteins (IAPs) which deactivate apoptotic proteins and (iii) phosphorylation of apoptotic proteins which prevents them from participating in signal transmission during apoptosis and as a result inhibits apoptosis in cancer cells. The aim of the study was to find a way to abolish the suppression of apoptosis in cancer cells and sensitize them to well-known anticancer drugs. Obtained results are focused on two main streams. According to the first approach it was proved that counteraction of suppression of apoptosis by CK2 protein kinase inhibitors usage (it is believed that phosphorylation by CK2 kinase can deactivate apoptotic proteins) is risky. Inhibition of CK2 activity results in pleiotropic consequences in cancer cells. Moreover, the effect of inhibitor strongly depends on the time-schedule of combination with anticancer drugs. Second approach was based on the direct delivery of recombinant BID protein fused with cell penetrating peptide TAT (TAT-BID), which allows to cross the plasma membrane. Due to the direct delivery of TAT-BID into the cells, it is was possible to observe that: 1. TAT-BID protein penetrate cancer cells in time-, concentration- and cell type-dependent manner. It makes possible to introduce strictly controlled amounts of the protein into the cell. 2. TAT-BID does not induce apoptosis in cancer cells and has very low cytotoxicity. 3. TAT-BID sensitize some of the cancer cell lines to well-known anticancer drugs even if initial resistance to them was observed. Moreover, this approach allows to reduce the dose of applied anticancer drugs, and as a consequence leads to lowered side effects resulting from the therapy. 4. For some cancer cell lines (PC3) and some anticancer drugs (doxorubicin) the amount of BID protein inside the cell is critical for induction of apoptosis. 5. Delivered TAT-BID protein is engaged in mitochondrial pathway of apoptosis in PC3 cells. 6. Phosphorylation of BID protein by CK2 protein kinase is not the main mechanism responsible for the suppression of apoptosis in tested cancer cell lines. Presented PhD dissertation possesses both, basic and applicable potential. On the one hand this work verifies the mechanism of apoptosis in some cancer cells (PC3). On the second hand it shows the possibility of sensitization some of the cancer cells to anticancer drugs, and opens up this way the opportunity to use it therapeutically, for example in the case of tumors which were a source of PC3, A549 and HeLa cells. The presented PhD project was supported by following sources of funding: three intramural grants from the donation of Ministry of Science and Higher Education for University of Warsaw (BW 501/86-1000030, BW 501/86-102341, DSM 501-86-104913), in which I was the manager. I also received funding from “Doktoraty dla Mazowsza II” project. Results that are the basis of this PhD dissertation were not only published as 3 original articles in journals from ISI Master Journal list (one paper in BMC Cancer, two papers in Oncology Reports) but they were also presented during four international congresses. These results also constitute the basis of two patent applications (Polish no. P.406626 and International no. PCT/IB2014/067117). Moreover, these results were awarded as an invention during International Trade Fair „Ideas-Inventions-New Products” iENA.