Praca doktorska
Miniatura
Pliki
0000-DR-172292-praca.pdf8.21 MB
Licencja
FairUseKorzystanie z tego materiału możliwe jest zgodnie z właściwymi przepisami o dozwolonym użytku lub o innych wyjątkach przewidzianych w przepisach prawa. Korzystanie w szerszym zakresie wymaga uzyskania zgody uprawnionego.
 

Synteza i biofizyczna charakterystyka modyfikowanych fragmentów ogona poli(A) jako narzędzi do manipulowania metabolizmem mRNA

Uproszczony widok
dc.abstract.plTechnologie oparte na potencjalnym zastosowaniu syntetycznych cząsteczek mRNA w medycynie rozwijane są od lat 90. ubiegłego wieku. Dzięki znaczącemu postępowi technologicznemu mRNA staje się coraz powszechniej stosowanym narzędziem w opracowywaniu szczepionek i terapii genowych. Mimo wielu zalet względem stosowanych dotychczas konwencjonalnych metod, jednym z głównych problemów terapii wykorzystujących syntetyczne mRNA jest inherentnie niska stabilność owych cząsteczek. Niezależnie od ścieżki rozpadu, proces degradacji mRNA w komórkach ssaków jest inicjowany przez deadenylację, czyli usunięcie ogona poli(A) znajdującego się na końcu 3' większości dojrzałych eukariotycznych mRNA. Ogon poli(A) działa jako jeden z głównych regulatorów losów mRNA, między innymi chroniąc regiony kodujące mRNA przed degradacją, a także odgrywając ważną rolę w procesie inicjacji translacji dzięki złożonym interakcjom białko-RNA. Obie te cechy, w połączeniu z niekodującą naturą ogona poli(A), czynią go idealnym celem do wprowadzenia korzystnych modyfikacji zwiększających stabilność i wydajność translacyjną mRNA, bez ingerencji w aktywność maszynerii rybosomalnej odpowiedzialnej za biosyntezę białek. W ostatnich latach zaprezentowano szereg badań dotyczących modyfikacji mRNA w celu manipulacji stabilnością oraz potencjałem translacyjnym mRNA, co stanowiło inspirację dla moich badań. Pierwsza część niniejszej rozprawy dotyczyła opracowania metody biofizycznej umożliwiającej badania nad zależnością struktura-aktywność w oddziaływaniu analogów ogona poli(A) z białkiem specyficznie wiążącym strukturę końca 3’ mRNA (PABP). W celu opracowania metody wykorzystałam czułą technikę termoforezy mikroskalowej, która pozwala na badanie szerokiego spektrum oddziaływań molekularnych. Opracowana metoda została wykorzystana do badania oddziaływań między białkiem PABP, a blisko trzydziestoma oligonukleotydowymi analogami ogona poli(A), zawierającymi wybrane chemiczne i strukturalne modyfikacje. Dzięki szczegółowym badaniom udało się ustalić wpływ danej modyfikacji na specyficzne oddziaływanie z PABP, nie tylko ze względu na rodzaj użytej modyfikacji, ale również jej umiejscowienie w kieszeni wiążącej białka. Przeprowadziłam również badania odporności enzymatycznej wspomnianych analogów poli(A) z udziałem specyficznej deadenylazy. Możliwe było wyszczególnienie chemicznie modyfikowanych oligonukleotydów poli(A) wykazujących równocześnie wysokie powinowactwo do PABP oraz odporność na enzymatyczną degradację. Z udziałem wybranych oligonukleotydów przeprowadzono następnie badania translacji w lizatach komórkowych, które wykazały, że wybrane przeze mnie związki wykazują potencjał inhibitorowy i specyficznie hamują proces translacji. Na podstawie niniejszej części badań wyciągnęłam szereg wniosków dotyczących wpływu struktury fragmentów poli(A) na ich powinowactwo do PABP. Między innymi owe badania dowiodły, że wszelkiego rodzaju modyfikacje chemiczne łańcucha poli(A) są najlepiej tolerowane, kiedy modyfikowana podjednostka znajduje się na końcu sekwencji wiązanej przez białko. Z tego względu w dalszej części badań skupiłam się na wprowadzaniu modyfikacji w obrębie samego końca 3’ RNA. Drugą część projektu doktorskiego poświęciłam na opracowanie metody pozwalającej na chemo-enzymatyczną modyfikację końca 3’ syntetycznych mRNA. Modyfikacja ta miała na celu zwiększenie stabilności cząsteczek mRNA poprzez poprawę ich odporności na degradację przez egzonukleazy 3’-5’, przy jednoczesnym zachowaniu możliwości oddziaływania z białkiem PABP. Poprawa stabilności przyczynia się następnie do wydłużenia czasu życia modyfikowanych mRNA w komórkach i skutkuje zwiększoną produkcją kodowanych przez mRNA białek. Opracowana przeze mnie metoda modyfikacji zakłada ligację enzymatyczną chemicznie 5’-fosforylowanych modyfikowanych dinukleotydów do końca 3’ cząsteczki RNA. Do struktury wspomnianych dinukleotydów wprowadzone zostały modyfikacje chemiczne, które w trakcie pierwszej części badań zidentyfikowane zostały jako najoptymalniejsze z punktu widzenia oddziaływania z PABP oraz stabilności enzymatycznej. Metoda modyfikacji końca 3’ RNA wykorzystana została do otrzymania reporterowych cząsteczek mRNA o zwiększonej stabilności. Modyfikowane mRNA zostały następnie zbadane w trzech różnych liniach komórkowych pod kątem ich potencjału translacyjnego. Zidentyfikowane zostały dwa typy modyfikacji mRNA, które skutkowały nawet kilkukrotnie zwiększoną produkcją białka w komórkach. Opracowane przeze mnie metody mogą przyczynić się do dalszych badań nad modyfikacjami ogona poli(A) mRNA. Z jednej strony, metoda pozwalająca na badanie oddziaływania między PABP a analogami poli(A) znajdzie zastosowanie w dalszych badaniach nad potencjalnie korzystnymi modyfikacjami poli(A). Z kolei metoda chemo-enzymatycznej modyfikacji końca 3’ RNA może być stosowana w otrzymywaniu dowolnych cząsteczek RNA o zwiększonej stabilności, w szczególności mRNA o potencjale terapeutycznym.
dc.abstract.plmRNA-based technologies in medicine have been developed since the 1990s. Thanks to significant technological advances, mRNA is becoming an increasingly widely used tool in the development of vaccines and gene therapies. Despite many advantages over the conventional methods used so far, one of the main problems of mRNA-based therapies is the innate low stability of mRNA molecules. Regardless of the pathway, the process of mRNA degradation in mammalian cells is initiated by deadenylation, the removal of the poly(A) tail located at the 3' end of most mature eukaryotic mRNAs. The poly(A) tail acts as one of the major regulators of mRNA fate, including protecting mRNA coding regions from degradation, as well as playing an important role in translation initiation through complex protein-RNA interactions. Both these features, coupled with the non-coding nature of the poly(A) tail, make it an ideal target for beneficial modifications to enhance mRNA stability and translational efficiency, without interfering with the activity of the ribosomal machinery responsible for protein biosynthesis. In recent years, several studies have been presented on mRNA modification to manipulate the stability and translational potential of mRNA, which inspired my research. The first part of this dissertation concerned the development of a biophysical method to study the structure-activity relationship in the interaction of poly(A) tail analogs with a protein that specifically binds the 3' end structure of mRNA (PABP). To develop the method, I used the sensitive microscale thermophoresis technique, which allows studying of a wide spectrum of molecular interactions. The developed method was used to study interactions between PABP and nearly thirty oligonucleotide analogs of the poly(A) tail, featuring selected chemical and structural modifications. Through detailed studies, I was able to determine the effect of a given modification on a specific interaction with PABP, stemming not only from the type of modification used, but also its location in the protein-binding pocket. I also carried out enzymatic resistance studies of aforementioned poly(A) analogs involving a specific deadenylase CNOT7. I selected poly(A) analogs showing simultaneously high affinity for PABP and resistance to enzymatic degradation. Translation studies in cell lysates were then carried out with chosen oligonucleotides, which showed that the compounds I selected exhibited inhibitory potential and specifically inhibited the translation process. Based on this part of the research, I have drawn a number of conclusions about the influence of the structure of poly(A) fragments on their affinity for PABP. Among other things, these studies proved that all kinds of chemical modifications of the poly(A) chain are best tolerated when the modified subunit is located at the end of the sequence bound by the protein. For this reason, in the remainder of my research I focused on making modifications within the 3' end of the RNA itself. I devoted the second part of my doctoral project to developing a method that allows chemo-enzymatic modification of the 3' end of synthetic mRNAs. This modification was aimed at increasing the stability of mRNA molecules by improving their resistance to degradation by 3'-5' exonucleases, while maintaining their ability to interact with the PABP protein. The improved stability contributes to the extended lifespan of modified mRNAs in cells and results in increased production of mRNA-encoded proteins. The modification method I developed involves enzymatic ligation of chemically 5'-phosphorylated modified dinucleotides to the 3' end of any RNA chain. Chemical modifications were introduced into the structure of the dinucleotides, which were identified during the first part of the study as optimal from the point of view of interaction with PABP and enzymatic stability. The modification method was used to obtain reporter mRNA molecules exhibiting increased stability. Modified mRNAs were then tested in three different cell lines for their translational potential. Two types of mRNA modifications were identified that resulted in up to several times increased protein production in the cells. The methods I have developed can contribute to further research on poly(A) mRNA tail modifications. Biophysical method that allows the study of the interaction between PABP and poly(A) analogs will find application in further studies of potentially beneficial poly(A) modifications. Moreover, the method of chemo-enzymatic modification of the 3' end of RNA can be used in obtaining any RNA molecules with increased stability, especially mRNAs with therapeutic potential.
dc.affiliation.departmentWydział Fizyki
dc.contributor.authorPerzanowska, Olga
dc.date.accessioned2023-12-01T06:29:44Z
dc.date.available2023-12-01T06:29:44Z
dc.date.defence2023-12-11
dc.date.issued2023-12-01
dc.description.additionalLink archiwalny https://depotuw.ceon.pl/handle/item/4804
dc.description.promoterJemielity, Jacek
dc.description.promoterKowalska, Joanna
dc.identifier.urihttps://repozytorium.uw.edu.pl//handle/item/4804
dc.language.isopl
dc.rightsFairUse
dc.subject.pltranskrypcja in vitro
dc.subject.plchemiczna modyfikacja
dc.subject.pltermoforeza mikroskalowa
dc.subject.plPABP
dc.subject.plpotencjał terapeutyczny
dc.subject.plstabilność transkryptów
dc.subject.pldeadenylacja
dc.subject.pltranslacja
dc.subject.plkoniec 3'
dc.subject.plmRNA
dc.subject.plpoli(A)
dc.subject.plin vitro transcription
dc.subject.plchemical modification
dc.subject.plmicroscale thermophoresis
dc.subject.plPABP
dc.subject.pltherapeutical potential
dc.subject.plstability of transcripts
dc.subject.pldeadenylation
dc.subject.pltranslation
dc.subject.pl3' end
dc.subject.plmRNA
dc.subject.plpoly(A)
dc.titleSynteza i biofizyczna charakterystyka modyfikowanych fragmentów ogona poli(A) jako narzędzi do manipulowania metabolizmem mRNA
dc.title.alternativeSynthesis and biophysical evaluation of modified poly(A) tail fragments as tools for mRNA metabolism manipulation
dc.typeDoctoralThesis
dspace.entity.typePublication