Rola kompleksu Hira w regulowaniu Gli3R-zależnej transkrypcji genów szlaku sygnałowego Hedgehog

Ścieżka sygnałowa Hedgehog (Hh) włączona jest w regulację rozwoju zarodkowego, podziałów i różnicowania komórek. Zaburzenia w jej aktywności skutkują m.in. rozwojem nowotworów mózgu, trzustki oraz prostaty. Ścieżka Hh reguluje ekspresję genów poprzez czynniki transkrypcyjne Gli. Białka Gli1 i Gli2 pełnią funkcję aktywatorów (GliA), podczas gdy Gli3 działa głównie jako represor transkrypcji (GliR). Jak dotąd niewiele wiadomo na temat mechanizmów Gli3-zależnej represji genów. Łącząc wyniki badań wielkoskalowych opartych o spektrometrię mas z wynikami badań przesiewowymi metodą CRISPR/Cas9 wytypowałam białko Hira jako regulatora Gli3R-zależnej represji genów. Kompleks Hira jest odpowiedzialny za niezależne od cyklu komórkowego włączanie histonów H3.3/H4 do chromatyny, co pozwala na regulację ekspresji genów. Pomimo dowodów na udział kompleksu Hira w procesie represji genów oraz jego funkcjonalnej i fizycznej interakcji z białkiem Gli3, jak dotąd nie wykazano jego związku z regulacją aktywności ścieżki Hedgehog. Postawiłam hipotezę, że kompleks Hira włączony jest w zależną od Gli3 regulację ekspresji genów i działać może jako ko-represor białka Gli3R. Podczas realizacji niniejszej pracy doktorskiej zastosowałam techniki inżynierii genetycznej m.in. transdukcję lentiwirusową, mutagenezę CRISPR-Cas9, system indukcji ekspresji Tet-On, system ekspresji Flp-InTM. Doświadczenia prowadziłam na mysiej linii komórkowej NIH/3T3 oraz ludzkich komórkach Daoy i HEK293T. Badanie miejsc przyłączania się czynnika transkrypcyjnego Gli3R do chromatyny przeprowadziłam metodą CUT&RUN połączoną z sekwencjonowaniem nowej generacji, natomiast do badań transkryptomicznych wykorzystałam metodę RNAseq. Przeprowadziłam również barwienia immunofluorescencyjne, testy migracji komórek (test gojenia ran, test migracji przez inserty) oraz analizę cytometryczną. W wyniku przeprowadzonych badań potwierdziłam oddziaływanie kompleksu Hira i białka Gli3R oraz wykazałam, że może ono zachodzić jedynie w obecności białek Cabin1 i Ubn1/2. Zaburzenie funkcji Hira prowadziło do zwiększonej aktywności ścieżki Hh, co przejawiało się wyższym poziomem białka Gli1. Nie obserwowałam przy tym zmian w poziomie represora Gli3R ani białka Gli3FL. Badanie CUT&RUN pokazało, że na promotorach genów zależnych od Hh, w komórkach z nokautem Hira, znajduje się więcej czynnika transkrypcyjnego Gli3R, co sugeruje, że regulacja genów docelowych ścieżki Hh przez Hira nie jest bezpośrednia. Nokaut Hira w komórkach nowotworowych Daoy pokazał, że Hira jest niezbędna dla żywotności i zdolności do podziałów komórek nowotworowych, a także wspomaga proces migracji i przejścia nabłonkowo-mezynchymalnego. Wyniki tych doświadczeń znalazły odzwierciedlenie w badaniu transkryptomicznym RNAseq. Niniejsza praca doktorska przedstawia nowy, nie zbadany jak dotąd związek pomiędzy czynnikami transkrypcyjnymi Gli a kompleksem Hira. Prezentowane wyniki stanowią więc wkład w zrozumienie mechanizmów regulacji aktywności szlaku przekazywania sygnału Hedgehog i wskazują nowe, potencjalne kierunki badań nad terapią Hh-zależnych nowotworów.

The Hedgehog (Hh) signalling pathway is involved in the regulation of embryonic development, cell division and differentiation. Disturbances in its activity result in the development of brain, pancreatic and prostate cancers, among others. The Hh pathway regulates gene expression through the Gli transcription factors. Gli1 and Gli2 proteins act as activators (GliA), while Gli3 acts mainly as a transcriptional repressor (GliR). To date, little is known about the mechanisms of Gli3-mediated gene repression. Combining the results of large-scale mass spectrometry-based studies with CRISPR/Cas9-based screening, I have identified the Hira protein as a regulator of Gli3R-dependent gene repression. The Hira complex is responsible for the cell cycle-independent incorporation of histones H3.3/H4 into chromatin to regulate gene expression. Despite evidence for the involvement of the Hira complex in gene repression and its functional and physical interaction with the Gli3 protein, its association with the regulation of Hedgehog pathway activity has not yet been demonstrated. I hypothesised that the Hira complex is involved in Gli3-dependent regulation of gene expression and may act as a co-repressor of the Gli3R protein. In my doctoral work, I applied genetic engineering techniques including lentiviral transduction, CRISPR-Cas9 mutagenesis, Tet-On expression induction system, Flp-InTM expression system. I conducted experiments on the mouse NIH/3T3 cell line and human Daoy and HEK293T cells. I investigated Gli3R-chromatin binding sites using the CUT&RUN method combined with next-generation sequencing, while I used the RNAseq method for transcriptomic studies. I also performed immunofluorescence staining, cell migration assays (scratch assay, migration through inserts assay) and cytometric analysis. As a result, I confirmed the interaction between the Hira complex and the Gli3R protein and demonstrated that this can only occur in the presence of Cabin1 and Ubn1/2 proteins. Disruption of Hira function led to increased activity of the Hh pathway, which was manifested by higher levels of Gli1 protein. However, I did not observe changes in the levels of the Gli3R repressor or the Gli3FL protein. The CUT&RUN assay showed that there was more Gli3R transcription factor on the promoters of Hh-dependent genes in Hira knockout cells, suggesting that the regulation of Hh pathway target genes by Hira is indirect. The Hira knockout in Daoy cancer cells showed that Hira is essential for the viability and proliferation of cancer cells, as well as assisting in migration and epithelial-mesenchymal transition. The results of these experiments were reflected in the RNAseq transcriptomic study. This PhD thesis reveals a new, so far unexplored relationship between Gli transcription factors and the Hira complex. The results presented here therefore contribute to the understanding of the mechanisms regulating the activity of the Hedgehog pathway and point to new potential research directions for Hh-dependent cancer therapy.