Analiza ekspresji genów zegara biologicznego w męskim układzie rozrodczym ssaków

Funkcjonowanie centralnego zegara biologicznego ssaków jest dobrze udokumentowane. Przedmiotem dyskusji pozostaje jednak istnienie tego mechanizmu w narządach męskiego układu rozrodczego. Rytmiczna ekspresja genów oscylatora molekularnego (Per1, Per2, Cry1, Cry2, Bmal1, Clock) i cykliczne zmiany poziomu kodowanych przez nie białek stanowią jedno z podstawowych kryteriów wykorzystywanych do identyfikacji zegarów peryferycznych u zwierząt. Dodatkowo przypuszczać należy, że oscylator molekularny, potencjalnie zlokalizowany w narządach męskiego układu rozrodczego może regulować procesy fizjologiczne charakterystyczne dla tego układu takie jak rozwój komórek linii płciowej czy produkcja hormonów płciowych i metabolizm steroidów. Zaangażowane w regulacje tych procesów są min. receptor androgenowy, białko StAR warunkujące transport steroidów przez błony mitochondriów i tym samym produkcję testosteronu oraz aromataza- enzym odpowiedzialny za przekształcanie testosteronu w estrogeny. Dodatkowo istnieją dane literaturowe wskazujące na związki genów i białek zegara biologicznego z czynnikami odpowiedzialnymi za nowotworzenie. Także receptor androgenowy pełni istotną role w powstawaniu nowotworów męskiego układu rozrodczego. Procesem który może wpływać zarówno na funkcjonowanie oscylatora molekularnego jaki i procesy prowadzące do transformacji nowotworowej jest starzenie organizmu.Biorąc to pod uwagę, celem niniejszej rozprawy doktorskiej było ustalenie czy w narządach męskiego układu rozrodczego myszy 10, 60 i 105 tygodniowych oraz komórkach Leydiga (in vivo i in vitro) zachodzi rytmiczna ekspresja genów zegara biologicznego, genu receptora androgenowego i genów związanych z metabolizmem steroidów (geny Cyp19 i StAR) stosując metodę ilościowego pomiaru kopii transkryptów (qPCR).Celem było także zbadanie czy poziom białka receptora androgenowego zmienia się rytmicznie w ciągu doby na terenie jąder i komórek Leydiga (in vivo i in vitro) wykorzystując metody immunocytochemiczne i Western Blot. Wykorzystując testy ELISA zbadano dobowe zmiany poziomu testosteronu, 5α-dihydrotestosteronu i estradiolu w surowicy myszy 10, 60 i 105 tygodniowych.Wykazano rytmiczne zmiany genów zegara biologicznego, receptora androgenowego, aromatazy i genu StAR w większości narządów męskiego układu rozrodczego myszy i w komórkach Leydiga in vitro. Starzenie się zwierząt ma wpływ na ekspresję genów zegara biologicznego, receptora androgenowego, aromatazy i StAR. Poziom receptora androgenowego zmienia się cyklicznie w komórkach Leydiga in vitro, brak natomiast wyraźnego rytmu dobowych zmian w jądrach myszy w różnym wieku. W surowicy badanych myszy występują dobowe rytmy zmian stężeń badanych hormonów płciowych, których profile zmieniają się z wiekiem zwierząt.

The mammalian central biological (circadian) clock is a well-known and documented mechanism. However existence of clockwork mechanism in organs of male reproductive system still is under discussion. Rhythmic expression of core clock gens (Per1, Per2, Cry1, Cry2, Bmal1, Clock) and proteins is a one of immanent feature used to identify peripheral circadian clocks. Additionally it is likely that molecular circadian oscillator supposedly located in male reproductive system may regulate physiology of these organs affecting process like sperm maturation, hormone secretion and steroid metabolism. Crucial for proper functioning of these processes are many genes, enzymes and proteins including androgen receptor, StAR protein responsible for cholesterol trafficking across mitochondrial membrane and consequently testosterone production and aromatase- enzyme responsible for biosynthesis of estrogens from androgens. Moreover recent findings revealed also that pathways critical to tumorigenesis are linked with circadian system and role of androgen receptor in development of male reproductive system tumors is well established. Noteworthy, ageing is the process that links and affect both circadian clock mechanism and tumorigenesis.Taking all that into account, the aim of this doctoral dissertation was to verify using qPCR method whether rhythmic gene expression of molecular clock, androgen receptor, Cyp19 aromatase gene and StAR gene occurs in organs of male reproductive system of mice of different age (10, 60 and 105 weeks of age) as well as in Leydig cells in vitro. The aim of this study was also to determine using immunohistochemistry and Western Blots if level of androgen receptor varies rhythmically in cytoplasm and nucleus of Leydig cells (in vivo and in vitro). Moreover levels of testosterone, 5α-dihydrotestosterone and estradiol in serum of 10, 60 and 105 weeks old mice were assessed using ELISA tests.Results show rhythmic expression of molecular clock androgen receptor, aromatase and StAR genes is most of studied organs of male reproductive system as well as in Leydig cells in vitro. Moreover ageing affects expression of these genes in reproductive system of mice. Androgen receptor level changes rhythmically in cultured Leydig cells, but not in testis of mice of different age. Additionally concentrations of studied sex hormones in serum of mice of different age changed rhythmically during a day and profiles of this rhythms changed with age.