Badania właściwości elektrochemicznych mitochondrialnego kanału potasowego ROMK2 rekonstytuowanego w czarne błony lipidowe oraz w dwuwarstwy lipidowe tworzone na stałym podłożu

Podstawową funkcją mitochondrialnych kanałów potasowych jest regulacja potencjału wewnętrznej błony mitochondrialnej, dzięki czemu mogą one odgrywać zasadniczą rolę w zjawisku cytoprotekcji, zwłaszcza w przypadku niedotlenienia komórek. Aby zrozumieć wpływ kanałów potasowych na procesy neuroprotekcyjne i kardioprotekcyjne, kluczowa wydaje się znajomość właściwości elektrofizjologicznych i farmakologicznych tych białek. Jednym z kanałów potasowych obecnych w wewnętrznej błonie mitochondrialnej jest mitochondrialny kanał potasowy regulowany przez ATP (kanał mitoKATP) – tworzony przez białko ROMK2 (ang. Renal Outer Medullary Potassium Channel). Białko to tworzy por dzięki któremu zachodzi selektywny transport jonów potasu przez wewnętrzną błonę mitochondrialną. Elektrochemiczna charakterystyka tego kanału jest niezbędna dla zrozumienia procesów regulacji jego aktywności, co pozwala na określenie jego roli w procesach towarzyszących zawałowi serca, czy udarowi mózgu. Celem niniejszej rozprawy doktorskiej była elektrochemiczna charakterystyka kanału potasowego regulowanego przez ATP – kanału ROMK2 - wbudowanego w modelowe błony biologiczne. Białko ROMK2 rekonstytuowano w dwa układy: czarne błony lipidowe (ang. Black Lipid Membrane, BLM) oraz błony lipidowe tworzone na stałym podłożu (ang. tethered bilayer lipid membrane, tBLM). Pierwsza część rozprawy przedstawia wyniki syntezy mitochondrialnego kanału potasowego ROMK2 w obecności nanodysków lipidowych z wykorzystaniem systemu bezkomórkowej ekspresji białek. Nanodyski lipidowe o średnicy 9-10 nm zbudowane były z białka szkieletowego oraz z lipidu POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-fosfocholina). Zastosowany system jest techniką zdecydowanie lepszą i szybszą niż ekspresja białek w bakteriach E. coli i ich oczyszczanie z zastosowaniem detergentów. W następnej części pracy doktorskiej przeprowadzono rekonstytucję białka kanałowego ROMK2 wbudowanego w nanodyski lipidowe do modelowych układów sztucznych błon biologicznych: czarnych błon lipidowych oraz do dwuwarstwy lipidowej tworzonej na stałym podłożu. Błony wykorzystywane do rekonstytucji były tworzone z azolektyny sojowej. Azolektyna sojowa wykorzystywana podczas badań zawierała 37% fosfatydylocholiny (PC), 28% fosfatydyloetanoloaminy (PE), 20% fosfatydyloseryny (PS), 8% kwasu fosfatydowego (PA) i 7% kardiolipiny (CL). Dzięki wykorzystaniu czarnych błon lipidowych oraz dwuwarstw lipidowych tworzonych na stałym podłożu, możliwe były badania charakterystyki prądowo-napięciowej (I-V) białka oraz charakterystyki wpływu modulatorów kanałów potasowych na aktywność tego kanału jonowego. Następnie zbadano właściwości kanału potasowego ROMK2 z wykorzystaniem technik elektrochemicznych - cyklicznej woltamperometrii, woltamperometrii prądu zmiennego oraz elektrochemicznej spektroskopii impedancyjnej. Techniki te pozwoliły na sprawdzenie w jaki sposób inhibitor (ATP/Mg2+), aktywator (diazoksyd) oraz zmiany potencjału błonowego wpływają na aktywność transportową badanego białka. Podsumowując, w niniejszej rozprawie doktorskiej z powodzeniem otrzymano białko ROMK2 wbudowane w nanodyski lipidowe wykorzystując metodę bezkomórkowej ekspresji. Dokonano rekonstytucji badanego kanału w dwa różne układy modelowe sztucznych błon biologicznych. Zbadano wpływ potencjału oraz modulatorów badanego białka na jego aktywność. Otrzymane i scharakteryzowane systemy modelowe mogą być wykorzystane do identyfikacji substancji chemicznych regulujących aktywność mitochondrialnych kanałów potasowych. Czyli takich związków chemicznych, które mogą potencjalnie wpływać na zmniejszenie uszkodzenia komórek kardiomiocytów i neuronów w stanach niedotlenienia.