Praca doktorska
Licencja
Korzystanie z tego materiału możliwe jest zgodnie z właściwymi przepisami o dozwolonym użytku lub o innych wyjątkach przewidzianych w przepisach prawa. Korzystanie w szerszym zakresie wymaga uzyskania zgody uprawnionego.Badania właściwości elektrochemicznych mitochondrialnego kanału potasowego ROMK2 rekonstytuowanego w czarne błony lipidowe oraz w dwuwarstwy lipidowe tworzone na stałym podłożu
| dc.abstract.pl | Podstawową funkcją mitochondrialnych kanałów potasowych jest regulacja potencjału wewnętrznej błony mitochondrialnej, dzięki czemu mogą one odgrywać zasadniczą rolę w zjawisku cytoprotekcji, zwłaszcza w przypadku niedotlenienia komórek. Aby zrozumieć wpływ kanałów potasowych na procesy neuroprotekcyjne i kardioprotekcyjne, kluczowa wydaje się znajomość właściwości elektrofizjologicznych i farmakologicznych tych białek. Jednym z kanałów potasowych obecnych w wewnętrznej błonie mitochondrialnej jest mitochondrialny kanał potasowy regulowany przez ATP (kanał mitoKATP) – tworzony przez białko ROMK2 (ang. Renal Outer Medullary Potassium Channel). Białko to tworzy por dzięki któremu zachodzi selektywny transport jonów potasu przez wewnętrzną błonę mitochondrialną. Elektrochemiczna charakterystyka tego kanału jest niezbędna dla zrozumienia procesów regulacji jego aktywności, co pozwala na określenie jego roli w procesach towarzyszących zawałowi serca, czy udarowi mózgu. Celem niniejszej rozprawy doktorskiej była elektrochemiczna charakterystyka kanału potasowego regulowanego przez ATP – kanału ROMK2 - wbudowanego w modelowe błony biologiczne. Białko ROMK2 rekonstytuowano w dwa układy: czarne błony lipidowe (ang. Black Lipid Membrane, BLM) oraz błony lipidowe tworzone na stałym podłożu (ang. tethered bilayer lipid membrane, tBLM). Pierwsza część rozprawy przedstawia wyniki syntezy mitochondrialnego kanału potasowego ROMK2 w obecności nanodysków lipidowych z wykorzystaniem systemu bezkomórkowej ekspresji białek. Nanodyski lipidowe o średnicy 9-10 nm zbudowane były z białka szkieletowego oraz z lipidu POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-fosfocholina). Zastosowany system jest techniką zdecydowanie lepszą i szybszą niż ekspresja białek w bakteriach E. coli i ich oczyszczanie z zastosowaniem detergentów. W następnej części pracy doktorskiej przeprowadzono rekonstytucję białka kanałowego ROMK2 wbudowanego w nanodyski lipidowe do modelowych układów sztucznych błon biologicznych: czarnych błon lipidowych oraz do dwuwarstwy lipidowej tworzonej na stałym podłożu. Błony wykorzystywane do rekonstytucji były tworzone z azolektyny sojowej. Azolektyna sojowa wykorzystywana podczas badań zawierała 37% fosfatydylocholiny (PC), 28% fosfatydyloetanoloaminy (PE), 20% fosfatydyloseryny (PS), 8% kwasu fosfatydowego (PA) i 7% kardiolipiny (CL). Dzięki wykorzystaniu czarnych błon lipidowych oraz dwuwarstw lipidowych tworzonych na stałym podłożu, możliwe były badania charakterystyki prądowo-napięciowej (I-V) białka oraz charakterystyki wpływu modulatorów kanałów potasowych na aktywność tego kanału jonowego. Następnie zbadano właściwości kanału potasowego ROMK2 z wykorzystaniem technik elektrochemicznych - cyklicznej woltamperometrii, woltamperometrii prądu zmiennego oraz elektrochemicznej spektroskopii impedancyjnej. Techniki te pozwoliły na sprawdzenie w jaki sposób inhibitor (ATP/Mg2+), aktywator (diazoksyd) oraz zmiany potencjału błonowego wpływają na aktywność transportową badanego białka. Podsumowując, w niniejszej rozprawie doktorskiej z powodzeniem otrzymano białko ROMK2 wbudowane w nanodyski lipidowe wykorzystując metodę bezkomórkowej ekspresji. Dokonano rekonstytucji badanego kanału w dwa różne układy modelowe sztucznych błon biologicznych. Zbadano wpływ potencjału oraz modulatorów badanego białka na jego aktywność. Otrzymane i scharakteryzowane systemy modelowe mogą być wykorzystane do identyfikacji substancji chemicznych regulujących aktywność mitochondrialnych kanałów potasowych. Czyli takich związków chemicznych, które mogą potencjalnie wpływać na zmniejszenie uszkodzenia komórek kardiomiocytów i neuronów w stanach niedotlenienia. |
| dc.abstract.pl | The primary function of mitochondrial potassium channels is to regulate the mitochondrial inner membrane potential, so they can play an essential role in cytoprotection, especially in case of cell hypoxia. To understand the influence of potassium channels on neuroprotective and cardioprotective processes, it seems crucial to know the electrophysiological and pharmacological properties of these proteins. One of the potassium channels present in the inner mitochondrial membrane is the ATP-regulated mitochondrial potassium channel (mitoKATP channel) – created by the Renal Outer Medullary Potassium Channel (ROMK2) protein. This protein forms a pore through which potassium ions are selectively transported across the inner mitochondrial membrane. The electrochemical characteristics of this channel are crucial for understanding the regulation of its activity, which allows us to determine its role in the processes involved in myocardial infarction or stroke. The purpose of this dissertation was to electrochemically characterize an ATP-regulated potassium channel (mitoKATP channel) - the ROMK2 channel embedded in model biological membranes. ROMK2 protein was reconstituted into two systems: black lipid membrane (BLM) and tethered bilayer lipid membrane (tBLM). The first part of the thesis presents the results of the synthesis of the mitochondrial potassium channel ROMK2 in the presence of lipid nanodiscs using a cell-free protein expression system. The lipid nanodiscs, which were 9-10 nm in diameter, were composed of a scaffold protein and a POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine) lipid. The protein expression system used is a far better and faster technique than protein expression in E. coli bacteria and their purification with detergents. In the next part of the research, reconstitution of ROMK2 channel protein embedded in lipid nanodiscs was carried out into model systems of artificial biological membranes: black lipid membranes and into a lipid bilayer formed on a solid surface. The membranes used for reconstitution were formed from soy azolectin. The soybean azolectin used in the study contained 37% phosphatidylcholine (PC), 28% phosphatidylethanolamine (PE), 20% phosphatidylserine (PS), 8% phosphatidic acid (PA) and 7% cardiolipin (CL). With these two models, it was possible to study the current-voltage (I-V) characteristics of the protein and characterize the effect of a potassium channel activator and inhibitor on ion channel activity. The properties of the ROMK2 potassium channel were then investigated using electrochemical techniques - cyclic voltammetry, alternating current voltammetry and electrochemical impedance spectroscopy. They allowed us to see how the inhibitor (ATP/Mg2+), activator (diazoxide) and changes in membrane potential affect the transport activity of the studied protein. In conclusion, in this dissertation the ROMK2 protein embedded in lipid nanodiscs was successfully obtained using the method of cell-free expression. The examined channel was reconstituted into two different model systems of artificial biological membranes. The influence of the potential and modulators of the tested protein on its activity was examined. The obtained and characterized model systems can be used to identify chemical substances regulating the activity of mitochondrial potassium channels. That is, such chemical compounds that can potentially affect the reduction of damage to cardiomyocytes and neurons in hypoxia. |
| dc.affiliation.department | Wydział Chemii |
| dc.contributor.author | Stefanowska, Aleksandra |
| dc.date.accessioned | 2024-01-03T11:51:50Z |
| dc.date.available | 2024-01-03T11:51:50Z |
| dc.date.defence | 2024-01-11 |
| dc.date.issued | 2024-01-03 |
| dc.description.promoter | Krysiński, Paweł |
| dc.description.promoter | Szewczyk, Adam |
| dc.identifier.uri | https://repozytorium.uw.edu.pl//handle/item/4843 |
| dc.language.iso | pl |
| dc.rights | FairUse |
| dc.subject.pl | Aktywatory kanałów potasowych |
| dc.subject.pl | Dwuwarstwy lipidowe tworzone na stałym podłożu |
| dc.subject.pl | Czarne błony lipidowe |
| dc.subject.pl | Błony lipidowe |
| dc.subject.pl | Nanodyski lipidowe |
| dc.subject.pl | Kanały potasowe |
| dc.subject.pl | Mitochondrialne kanały jonowe |
| dc.subject.pl | Mitochondria |
| dc.subject.pl | Elektrochemiczna spektroskopia impedancyjna |
| dc.subject.pl | Potassium channel activators |
| dc.subject.pl | Tethered bilayer lipid membrane |
| dc.subject.pl | Black lipid membranes |
| dc.subject.pl | Lipid membranes |
| dc.subject.pl | Lipid nanodiscs |
| dc.subject.pl | Potassium channels |
| dc.subject.pl | Mitochondrial ion channels |
| dc.subject.pl | Mitochondria |
| dc.subject.pl | Electrochemical impedance spectroscopy |
| dc.title | Badania właściwości elektrochemicznych mitochondrialnego kanału potasowego ROMK2 rekonstytuowanego w czarne błony lipidowe oraz w dwuwarstwy lipidowe tworzone na stałym podłożu |
| dc.title.alternative | Electrochemical properties of the mitochondrial ROMK2 potassium channel reconstituted into the black lipid membrane and into tethered bilayer lipid membrane |
| dc.type | DoctoralThesis |
| dspace.entity.type | Publication |