Influence of the peritoneal microenvironment on ovarian cancer cells estimated by means of in-vitro cell culture techniques, microarray experiments and analysis of signaling pathways

Rak jajnika charakteryzuje się najwyższą śmiertelnością spośród wszystkich nowotworów ginekologicznych. Wiąże się to z faktem, że wykrycie następuje najczęściej na etapie przerzutów do jamy otrzewnej. Komórki z przerzutów otrzewnowych wykazują znacznie wyższą agresywność i zdolność do rozprzestrzeniania się w porównaniu z komórkami z guzów pierwotnych i z przerzutów w obrębie miednicy. Niniejsza praca prezentuje badania nad potencjalnym wpływem mikrośrodowiska jamy otrzewnej na komórki nowotworowe, w szczególności substancji wydzielanych przez komórki surowiczej błony otrzewnej. Komórki linii nabłonkowego raka jajnika SKOV-3 były traktowane charakterystycznymi dla płynu puchlinowego produktami sekrecji fibroblastów, komórek mezotelialnych i komórek nowotworowych. Przy ekspozycji na produkty sekrecji zarówno fibroblastów jak i mezotelium obserwowano wyraźny wzrost zdolności komórek SKOV-3 do proliferacji i migracji, przy czym efekt mitotyczny osiągany przy udziale mezotelium był znacznie silniejszy od tego uzyskanego przy udziale fibroblastów. Dodatkowo, w przypadku stymulacji medium wzbogaconym przez fibroblasty, komórki nowotworowe zyskiwały wyraźną oporność na cis-platynę i zdolność do przeżycia w warunkach nieadhezyjnych. Wbrew początkowym oczekiwaniom, analiza transkryptomów badanych komórek wykazała, że fibroblasty i komórki mezotelialne inicjują przeciwstawne mechanizmy w komórkach SKOV-3. Analiza transkryptomiczna wykazała, że medium wzbogacone przez fibroblasty stymuluje komórki SKOV-3 do odpowiedzi immunologicznej. Wyraża się to poprzez nadekspresję cytokin oraz ich receptorów, w szczególności cytokin prozapalnych IL-1 α, IL-1 β, IL-6, IL-32 i TNF, oraz chemokin IL-8, GRO-α, GRO-β i CCL-20. Dodatkowo aktywacji ulegają ewolucyjnie konserwowane mechanizmy odpowiedzi immunologicznej związane z układem dopełniacza oraz ze szlakiem kynureninowym zależnym od IDO. Analiza transkryptomów wskazuje na zwiększenie ekspresji genów związanych z motoryką komórki, proliferacją oraz mechanizmami przetrwalnymi. Dane transkryptomiczne wykazały, że transdukcja sygnału zachodzi za pośrednictwem szlaku NF-κβ zależnego od cytokin. Ekspresja genów związanych z odpowiedzią immunologiczną w komórkach linii SKOV-3 jest wyraźnie zahamowana w medium wzbogaconym w produkty sekrecji komórek mezotelialnych. Wyciszeniu ulega ekspresja genów charakterystycznych dla stymulacji fibroblastowej, zarówno na poziomie cytokin, chemokin i ich receptorów, szlaku metabolicznego IDO oraz układu dopełniacza. Wysokiej nadekspresji ulegają natomiast geny kodujące białka cyklu komórkowego, zarówno w porównaniu do kontroli negatywnej, jak i stymulacji fibroblastowej. Dane te odzwierciedlają wyniki dla proliferacji uzyskane w eksperymentach in vitro. Ekspresja białek motorycznych ma podobnie podwyższony poziom jak przy stymulacji fibroblastami. Nie obserwujemy natomiast zmian w poziomie ekspresji białek anty-apoptotycznych. Transkryptomy komórek SKOV-3 stymulowanych mezotelialnie charakteryzują się wyraźnie podwyższonym poziomem transkryptów kodujących transportery lipidów oraz enzymy związane z anabolizmem lipidów, a w szczególności syntezy cholesterolu i nienasyconych kwasów tłuszczowych oraz ich estryfikacją. Obserwujemy akumulację białek i jednonienasyconych kwasów tłuszczowych. Nadekspresji ulegają geny wchodzące w skład szlaku aktywacji lipidomicznych czynników transkrypcyjnych SREPB. Poprzez swoje produkty sekrecji fibroblasty i komórki mezotelialne wywierają na komórkach raka jajnika dwa przeciwstawne rodzaje stymulacji: immunogenną i immunosupresyjną. Wpływ zdrowego mezotelium na komórki raka jajnika obemuje zarówno działanie immunosupresyjne jak i lipidomiczną transformację metaboliczną.

Ovarian cancer has the highest mortality rate of all gynaecological cancers. This is due to the fact that detection occurs most often at the stage of metastasis to the peritoneal cavity. Cells from peritoneal metastases show significantly higher aggressiveness and dissemination rates compared to cells from primary tumours and pelvic metastases. This thesis presents research on the potential impact on cancer cells of the peritoneal cavity microenvironment, in particular the secretion products of cells of the serous peritoneal membrane. Cells of the SKOV-3 epithelial ovarian carcinoma line were treated with the secretion products of fibroblasts, mesothelial cells and tumour cells characteristic of ascitic fluid. When exposed to the secretion products of both fibroblasts and mesothelium, we observed a remarkable increase in the ability of SKOV-3 cells to proliferate and migrate, and the mitotic effect achieved with mesothelium was much higher than that achieved with fibroblasts. In addition, upon stimulation with a medium enriched by fibroblasts, tumour cells gained a clear resistance to cis-platinum and the ability to survive in non-adhesive conditions. Contrary to the initial expectations, the transcriptome analysis of the study cells showed that fibroblasts and mesothelial cells initiate opposing mechanisms in SKOV-3 cells. Transcriptomic analysis showed that the fibroblast-enriched medium stimulated SKOV-3 cells to an immune response. This is reflected by the overexpression of cytokines and their receptors, in particular the pro-inflammatory cytokines IL-1 α, IL-1 β, IL-6, IL-32 and TNF, and the chemokines IL-8, GRO-α, GRO-β and CCL-20. In addition, evolutionarily conserved immune response mechanisms related to the complement system and the IDO-dependent kynurenine pathway are activated. Transcriptome analysis indicates an increase in the expression of genes related to cell motility, proliferation and survival mechanisms. Transcriptomic data showed that signal transduction is mediated by the cytokine-dependent NF-κβ pathway. The expression of immune response-related genes in SKOV-3 cells is significantly inhibited in the medium enriched with mesothelial cell secretion products. The expression of genes characteristic of fibroblast stimulation is silenced, including: both the cytokines and chemokines, and their receptors, the IDO metabolic pathway and the complement system. On the other hand, genes encoding cell cycle proteins are highly overexpressed, both in comparison to the negative control and the fibroblast stimulation. These data reflect the results for proliferation obtained in vitro. The expression of motor proteins is similarly elevated as when stimulated with fibroblasts. However, we do not observe changes in the level of expression of anti-apoptotic proteins. The transcriptomes of mesothelial-stimulated SKOV-3 cells are characterized by clearly elevated levels of transcripts encoding lipid transporters and enzymes related to lipid anabolism, in particular the synthesis of cholesterol and unsaturated fatty acids, and their esterification. Accumulation of proteins and monounsaturated fatty acids is observed. Genes that are part of the activation pathway of lipidomic transcription factors SREPB are overexpressed. Through their secretion products, fibroblasts and mesothelial cells exert two opposing types of stimulation on ovarian cancer cells: immunogenic and immunosuppressive. The effects of the healthy mesothelium on ovarian cancer cells include both immunosuppressive effects and lipidomic metabolic transformation.