Praca doktorska
Ładowanie...
Oddziaływania statyn z modelowymi błonami biologicznymi w nieobecności i obecności enzymu odpowiedzialnego za syntezę cholesterolu
| dc.abstract.pl | Model tratw lipidowych błony biologicznej został wprowadzony przez Simonsa i Gerrita van Meera. Charakteryzuje się ściślejszym upakowaniem lipidów dzięki wzbogaceniu błony w sfingomielinę i cholesterol. Oba składniki tworzą ciekłą uporządkowaną (lo) strukturę, która jest oddzielona od ciekłej nieuporządkowanej (ld) fazy złożonej głównie z fosfolipidów. Mikrodomeny mają zdolność do kotwiczenia białek i odpowiadają za prawidłowe funkcjonowanie komórek. 3-hydroksy-3-metyloglutarylo-koenzym A (HMG-CoA) jest jednym z białek transbłonowych odpowiedzialnych za produkcję cholesterolu, a jego reduktaza (reduktaza HMG-CoA) jest zdolna do regulacji cyklu produkcji cholesterolu w hepatocytach. Reduktaza HMG-CoA to enzym wątrobowy zlokalizowany w błonach retikulum endoplazmatycznego (ER), którego charakterystyka odpowiada tratwom lipidowym. Właściwa praca tego enzymu zmniejsza ryzyko hipercholesterolemii i chorób układu krążenia, które są obecnie główną przyczyną zgonów na świecie. W celu przeciwdziałania zwiększonej produkcji cholesterolu stosuje się leki z grupy statyn. Obniżają poziom cholesterolu we krwi poprzez inhibitowanie miejsca katalitycznego reduktazy HMG-CoA, a ich skuteczność zależy od ich właściwości fizykochemicznych oraz oddziaływań z błoną komórkową. Przedstawione badania pokazują zależność między stopniem hydrofobowości trzech wybranych statyn (prawastatyny, fluwastatyny i ceriwastatyny) a ich oddziaływaniami z różnymi modelami błon biologicznych. Pierwszy z nich to model błon komórkowych nabłonka jelita cienkiego (DMPC:DMPE:DMPS) użyty jako pierwsza bariera dla wchłaniania statyn w organizmie oraz model tratw lipidowych (DOPC:Chol:SM) jako miejsca kotwiczenia reduktazy HMG-CoA. Do przygotowania i scharakteryzowania monowarstw fosfolipidowych na granicy faz powietrze-woda wykorzystano metodę Langmuira. Metodę odbiciowej spektroskopii absorpcyjnej w podczerwieni z modulowaną polaryzacją na granicy faz powietrze-woda (PM-IRRAS) użyto do określenia lokalizacji leku w membranach na granicy faz powietrze-woda. Organizację modeli tratw lipidowych pod wpływem statyn zobrazowano metodą mikroskopii kąta Brewstera (BAM) i potwierdzono w pomiarach przy użyciu metody rozpraszania promieniowania rentgenowskiego padającego pod małymi kątami (GIXD). Wykazano, że właściwości powierzchniowe tratw lipidowych zmieniają się pod wpływem statyn, a zmiany są tym większe, im bardziej lipofilowe są wybrane do badań statyny. Dodatkowo, im bardziej lipofilowa statyna, tym bardziej skuteczna jako lek obniżający poziom cholesterolu. Wyniki przedstawionych badań ujawniają specyficzne oddziaływania ceriwastatyny z modelowymi błonami lipidowymi, co może tłumaczyć stwierdzane często u pacjentów poważne skutki uboczne terapii tym lekiem, które w efekcie doprowadziły do jego wycofania z rynku farmaceutycznego. Reduktazę wbudowano w model tratw lipidowych (DOPC:Chol:SM 1:1:1) wykorzystując metodę tworzenia proteoliposomów. Wyniki pomiarów metodami Langmuira, dynamicznego rozpraszania światła i mikroskopii fluorescencyjnej potwierdziły obecność reduktazy HMG-CoA w biomimetycznych tratwach lipidowych. Jednak w prezentowanych badaniach najważniejszym aspektem było wykazanie, że w wybranym modelu błony reduktaza HMG-CoA zachowuje swoją aktywność. Wykorzystując metody spektrofotometrii UV-Vis i woltamperometrii cyklicznej opartej na reakcji utleniania NADPH do NADP+, udowodniono, że reduktaza nie traci swoich właściwości w wyniku wbudowania białka w błonę lipidową. Opracowano optymalną metodę rekonstytucji reduktazy HMG-CoA w modelowych tratwach lipidowych. Wyjaśniono specyfikę oddziaływania poszczególnych statyn z modelowymi błonami lipidowymi oraz udało się wykazać, że zrekonstytuowany w modelowej błonie enzym podlega inhibicji pod wpływem wybranych statyn. Otwiera to możliwości wykorzystania tego modelu błony w badaniach innych białek membranowych i ich inhibitorów. |
| dc.abstract.pl | The lipid rafts model of a biological membrane has been introduced by Simons and Gerrit van Meer. It is characterized by tighter lipid packing due to the enrichment of the membrane in sphingomyelin and cholesterol. Both components form a liquid-ordered (lo) structure, which is separated from liquid-disordered (ld) phase mainly composed of phospholipids. These microdomains are able to anchor proteins in their structure and they are responsible for proper functioning of cells. 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A (HMG-CoA) is one of the transmembrane proteins responsible for the production of cholesterol and its reductase (HMG-CoA reductase) is able to regulate cholesterol production cycle. It is a liver enzyme located in the membranes of the endoplasmic reticulum (ER) which characteristics correspond to lipid rafts. Proper work of this enzyme reduces the risk of hypercholesterolemia and cardiovascular diseases, which are the main cause of death nowadays. In order to counteract the increased production of cholesterol, statin drugs are used. They lower blood cholesterol level by inhibiting HMG-CoA reductase and their effectiveness depends on their physicochemical properties and interactions with cell membranes. The presented studies show the influence of the degree of hydrophobicity of three selected statins (pravastatin, fluvastatin and cerivastatin) on their interactions with different lipid models. First of them is a model of small intestinal epithelial cell membranes (DMPC:DMPE:DMPS) as the first barrier to the absorption of statins in the body, while the second one is a model of lipid rafts (DOPC:Chol:SM) as an anchoring point for HMG-CoA reductase. For this purpose, the Langmuir technique was used to prepare and characterize phospholipid monolayers at the air-water interface. Additionally, polarization modulation infrared reflection absorption spectroscopy (PM-IRRAS) was also employed to determine the drug localization in the membranes at the air-water interface. The organization of lipid raft models under influence of statins was imaged using Brewster angle microscopy (BAM) and confirmed with GIXD method. It was shown that lipid rafts change when they are exposed to statins. and the changes are larger when more lipophilic statins are used. On the other hand, these more lipophilic statins are known to be more effective as cholesterol decreasing agents. The results of presented studies reveal the specific nature of the interactions of cerivastatin with model membranes, which may explain the observed serious side effects of the therapy with this drug, which led to its withdrawal from the market. The reductase has been reconstituted in the model of lipid rafts (DOPC:Chol:SM 1:1:1). For this purpose, the method of proteoliposomes formation was used. Thanks to Langmuir method, dynamic light scattering and fluorescent microscopy methods the effectiveness of HMG-CoA reductase incorporation into the lipid raft system has been proved. However, in presented studies, the most important aspect was to obtain a model showing the activity attributed to catalytic site of HMG-CoA reductase. The UV-Vis spectrophotometry and cyclic voltammetry based on oxidation of NADPH to NADP+ reaction confirmed that reductase did not lose its properties in the process of incorporation of the protein into the lipid membrane. The present studies also show the inhibitory effect of the HMG-CoA reductase catalytic site by fluvastatin using a combination of the above-mentioned methods. Described experiments allowed us to determine the optimal method of HMG-CoA reductase incorporation into the model lipid rafts. Moreover, it revealed the specific nature of interaction of statins with model lipid membranes and, what is more important, proved that the reconstituted protein can also be inhibited by selected statins. |
| dc.affiliation.department | Wydział Chemii |
| dc.contributor.author | Zaborowska-Mazurkiewicz, Michalina |
| dc.date.accessioned | 2024-01-10T06:56:05Z |
| dc.date.available | 2024-01-10T06:56:05Z |
| dc.date.defence | 2024-02-21 |
| dc.date.issued | 2024-01-10 |
| dc.description.additional | Link archiwalny https://depotuw.ceon.pl/handle/item/4864 |
| dc.description.promoter | Matyszewska, Dorota |
| dc.description.promoter | Bilewicz, Renata |
| dc.identifier.uri | https://repozytorium.uw.edu.pl//handle/item/4864 |
| dc.language.iso | pl |
| dc.rights | ClosedAccess |
| dc.subject.pl | właściwości powierzchniowe |
| dc.subject.pl | metoda Langmuira |
| dc.subject.pl | białka transmembranowe |
| dc.subject.pl | reduktaza HMG-CoA |
| dc.subject.pl | modelowe błony lipidowe |
| dc.subject.pl | tratwy lipidowe |
| dc.subject.pl | statyny |
| dc.subject.pl | hipercholesterolemia |
| dc.subject.pl | surface properties |
| dc.subject.pl | Langmuir method |
| dc.subject.pl | transmembrane protein |
| dc.subject.pl | HMG-CoA reductase |
| dc.subject.pl | model lipid membranes |
| dc.subject.pl | lipid rafts |
| dc.subject.pl | statins |
| dc.subject.pl | hypercholesterolemia |
| dc.title | Oddziaływania statyn z modelowymi błonami biologicznymi w nieobecności i obecności enzymu odpowiedzialnego za syntezę cholesterolu |
| dc.title.alternative | Interactions of statins with model biological membranes in the absence and presence of the enzyme responsible for the synthesis of cholesterol |
| dc.type | DoctoralThesis |
| dspace.entity.type | Publication |