Wykorzystanie bakteriofagów i nanocząstek srebra do eradykacji biofilmów tworzonych przez bakterie Bordatella bronchiseptica i Escherichia coli

Biofilmy to złożone wielokomórkowe społeczności wielu gatunków mikroorganizmów. Bakterie wywołujące infekcje i tworzące biofilmy są trudne do leczenia ze względu na obecność zewnątrzkomórkowych substancji polimerowych ang. Extracellular Polymeric Substances. Związki te w znacznym stopniu ograniczają wnikanie leków i innych środków przeciwdrobnoustrojowych do komórki bakteryjnej. Biofilmy bakteryjne odgrywają istotną rolę w rozwoju przewlekłych i nawracających infekcji bakteryjnych. Są także ważnym czynnikiem problemu wielolekooporności. Wykazano także, że biofilmy ułatwiają horyzontalny transfer materiału genetycznego, prowadząc do rozprzestrzeniania się genów oporności na antybiotyki. Bakterie wielolekooporne (ang. Multiple Drug Resistant, w skrócie MDR) to organizmy oporne na co najmniej jeden środek przeciwdrobnoustrojowy. Według raportu WHO ”Worldwide country situation analysis: Response to antimicrobial resistance”, który ukazał się 29 kwietnia 2015 roku infekcje MDR będą powodować zgon 10 mln ludzi rocznie. W związku z tym podejmowane są znaczne wysiłki w celu opracowania alternatywnych dla antybiotyków metod zwalczania infekcji MDR. Skuteczność fagów w zwalczaniu bakterii została przedstawiona w badaniach nad zakażeniami m.in. Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus epidermidis, Escherichia coli. Zastosowanie bakteriofagów skutecznie redukuje biomasę biofilmów bakteryjnych. Niestety, pomimo działania bakteriofagów ograniczających wzrost biomasy biofilmu, biofilmy często wykazują zdolność do ponownego wzrostu. Nanocząstki srebra (AgNPs) również z powodzeniem były wykorzystywane w terapii przeciwdrobnoustrojowej, ale użycie samych nanocząstek srebra w wysokich stężeniach ma udowodnione działanie cytotoksyczne na organizmy eukariotyczne. Celem mojej rozprawy doktorskiej było opracowanie strategii połączenia fagoterapii i AgNPs w walce z biofilmami bakteryjnymi. Aby osiągnąć założony cel scharakteryzowano wirulentnego faga vB_BbrP_BB8 (BB8) wykazując, że może być on wykorzystywany do niszczenia biofilmów Bordetella bronchispetica. Możliwość wykorzystania faga BB8 w leczeniu infekcji bakteryjnych została potwierdzona w modelu in vivo, gdzie dowiedziono ponad 90% skuteczność w stosunku do organizmów nieleczonych fagiem. Jak wspomniano wyżej, pomimo działania bakteriofagów ograniczających wzrost biomasy biofilmu, biofilmy często wykazują zdolność do ponownego wzrostu. Dlatego też, kolejnym krokiem była konstrukcja bakteriofaga litycznego wiążącego nanocząstki srebra. W ramach pracy udowodniono, że zmodyfikowany fag wykazywał zwiększoną skuteczność w redukcji biomasy biofilmów w stosunku do niemodyfikowanych fagów. Co bardziej istotne, testy cytotoksyczności wykazały, że połączenie zmodyfikowanego faga i AgNPs są bezpieczne dla organizmu leczonego. Zwiększający się problem antybiotykoodporności skłonił mnie do zbadania skuteczności zmodyfikowanego faga w niszczeniu biofilmów w dłuższym okresie. W przedstawionej pracy doktorskiej przeprowadziłem analizę długotrwałego tzn. 24h i 48h działania przeciwdrobnoustrojowego litycznych fagów uzbrojonych w AgNPs na biofilmy E.coli. Wyniki potwierdziły założenia, że skuteczność mieszaniny uzbrojonego faga i AgNPs okazała się skuteczna w dłuższym przedziale czasu, ale okazało się również, że skuteczność antybiofilmowa rosła wraz z wydłużaniem się czasu działania mieszaniny. Na podstawie otrzymanych wyników można wnioskować, że taka kombinacja faga i AgNPs może być rozpatrywana jako skuteczna alternatywa dla antybiotyków. Wykonane przeze mnie badania mogą przyczynić się do dalszego rozwoju tej bardzo interesującej drogi naukowej dotyczącej potencjalnych zastosowań naukowych i medycznych obejmujących połączenie fagów i nanocząstek.

Biofilms are complex multicellular communities composed of multiple species of microorganisms. Bacteria that cause infections and form biofilms are difficult to treat due to the presence of extracellular polymeric substances. These substances significantly limit the penetration of drugs and other antimicrobial agents into bacterial cells. Bacterial biofilms play a crucial role in the development of chronic and recurrent bacterial infections and are also a significant factor of multidrug resistance. It has also been shown that biofilms facilitate horizontal gene transfer, leading to the spread of antibiotic resistance genes. Multidrug-resistant (MDR) bacteria are organisms resistant to at least one antimicrobial agent. According to the WHO report “Worldwide country situation analysis: Response to antimicrobial resistance,” published on April 29, 2015, MDR infections are projected to cause 10 million deaths annually. Therefore, significant efforts are being made to develop alternatives to antibiotics for combating MDR infections. The efficacy of phages in combating bacteria has been demonstrated in studies on infections caused by such pathogens as Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus epidermidis, and Escherichia coli. The use of bacteriophages effectively reduces the biomass of bacterial biofilms. Despite the action of bacteriophages limiting biofilm biomass growth, biofilms often exhibit the ability to regrow. Silver nanoparticles (AgNPs) have also been successfully used in antimicrobial therapy, but using of silver nanoparticles alone in high concentrations has proven cytotoxic effects on eukaryotic organisms. The goal of my PhD was to develop a strategy combining phage therapy and AgNPs to combat bacterial biofilms. To achieve this aim, the virulent phage vB_BbrP_BB8 (BB8) was characterized, demonstrating that it could be used to destroy Bordetella bronchiseptica biofilms. The potential use of phage BB8 in treating bacterial infections was confirmed in an in vivo model, showing over 90% efficacy compared to untreated organisms. As mentioned earlier, despite the action of bacteriophages limiting biofilm biomass growth, biofilms often exhibit the ability to regrow. Therefore, the next step was to construct a lytic bacteriophage armed silver nanoparticles. The study demonstrated that the modified phage showed increased effectiveness in reducing biofilm biomass compared to unmodified phages. More importantly, cytotoxicity tests showed that the combination of the modified phage and AgNPs is safe for the treated organism. The increasing problem of antibiotic resistance prompted me to investigate the efficacy of the modified phage in destroying biofilms over a longer period. In my PhD, I conducted an analysis of the long-term, 24-hour and 48-hour antimicrobial activity of lytic phages armed with AgNPs on E. coli biofilms. The results confirmed the hypothesis that the effectiveness of the armed phage and AgNPs mixture was effective over a longer period, and it was also found that the anti-biofilm efficacy increased with the prolonged action of the mixture. Based on the obtained results, it can be concluded that such a combination of phage and AgNPs can be considered a viable alternative to antibiotics. The research I conducted may contribute to the further development of this fascinating scientific field concerning potential scientific and medical applications involving the combination of phages and nanoparticles.