Praca doktorska
Ładowanie...
Spectroscopic studies of interactions of molecular targets in chemotherapy: Purine Nucleoside Phosphorylase, Thymidylate Synthase and their mutants with specific ligands
| dc.abstract.en | The medicine achievements and development helped us to treat or eradicate dis eases that were not curable years ago. The unstoppable evolution of medicine prolongs and ameliorates humans lifespan. With this undisputed advantage, however comes another challenge, cancer. In high-income populations this type of disease is one of the main players in the death rate. However, evolving treatment types, based on the constant growth of the knowledge related to the basis of the carcinogenesis, help us to treat or prevent the development to the next stages of the cancer. Among multiple treatment methods are transfections of the tumour cells with a ”target protein” and designing more effective small molecule inhibitors which relates to the subject of this dissertation, namely mechanisms of interaction with inhibitors of two enzymes (Purine Nucleoside Phosphorylase and Thymidylate synthase) that play an important role in the DNA recycling and synthesis. Purine Nucleoside Phosporylase executes purine base salvage via a reversible phosphorolysis of the (deoxy)ribonucleosides, leading to the glycosidic bond (between a purine base and sugar) cleavage, with phosphate acting as the second substrate and the reaction product, free purine ring, available to be used in DNA synthesis. Thymidylate Synthase, on the other hand, catalyses the conversion of dUMP to dTMP that is incorporated into DNA. The present Ph.D dissertation demonstrates studies aimed at (i) analysis of the spectroscopic properties of two molecular targets in chemotherapy, E.coli Purine Nu cleoside Phosphorylase (PNPr) and M. musculus Thymidylate synthase (mTS), and their mutants, and (ii) spectroscopic characterization of interactions of the above en zymes and their mutants with chosen ligands, formycine A (with PNP enzymes) and dUMP, FdUMP and N4 -OH-dCMP (with mTS enzymes). In more details, regarding E.coli Purine Nucleoside Phosphorylase, the author wanted to determine (i) the role of Phe159 and Tyr160 in the interactions with nucleosides (formycin A was used as a nucleoside representative) and (ii) the role of the π - π stacking between formycin A-Phe159-Tyr160. Moreover, the author wanted to verify the hypothesis that Tyr160 is the only excitation energy donor to the formycin A. Additionally, a secondary goal was a spectral characterisation of the E.coli Purine Nucleoside Phosphorylase chosen mutants: PNPF159Y (PNPY), PNPF159A (PNPA), PNPY160F (PNPF) and PNPY160S (PNPS). Goals related to the second subject of this dissertation, M. musculus Thymidylate Synthase, included (i) testing the hypothesis of uncoupling of two component reac tions apparently involved in the TS-catalyzed reaction, resulting from a slow-binding inhibition by N4 -OH-dCMP, (ii) evaluation of the electrostatic potential role in the in teractions between mTS and nucleotides and last but not least, (iii) spectroscopic char acterization of mTS and its two mutants: H190A and W103G. E.coli Purine Nucleoside Phosphorylase Results obtained for PNPr, its mutants and their complexes with formycin A (FA) provide an evidence of Phe159 and Tyr160 being amino acids residues essential for an efficient FA binding. All used methods, absorption and fluorescence spectroscopy, dissociation constants, FRET efficiency calculations and the study of impact of FA on the fluorescence decay parameters revealed that the lack of Phe159 (PNPA mutant) results in the loss of PNP ability to efficiently bind the nucleoside. The results testified rather to a collisional quenching of the PNPA fluorescence proving the lack or very weak FA binding to the active site of the PNPA enzyme. Surprising results were obtained for the PNPY mutant (PNPF159Y, Phe159 replaced with Tyr) that were not only related to the interactions with formycin A but also to spectroscopic properties of the investigated mutant. Investigations showed the forma tion of the tyrosinate anion (Tyr) and its excited state (Tyr∗), that influenced absorption and emission spectra, fluorescence decay parameters (presence of an additional de cay component) and caused substantial diminution of FRET between PNPY and FA (relative to PNPr). Overall results, although showed only a small increase of the FA emission intensity in the complex with PNPY (relative to PNPr), testified that this ob servation is caused by the presence of the Tyr∗ and possibly perpendicular orientation between transition moments of the donor (Tyr159/Tyr160) and acceptor (FA). It was proved that PNPY strongly binds FA to the active site (in the presence of phosphate even more efficiently than PNPr), showing that the PNPY mutant is a very promising target for future investigations. Moreover, the presented results showed that Tyr160 plays a crucial role in the effective FA binding to the active site of PNP. Mutants de prived of this amino acid (PNPY160F and PNPY160S) were not able to form stable complexes with formycin A. Both, absorption and fluorescence difference spectra did not present any tendency towards signs of static interactions, suggesting rather colli sional exchange of the fluorescence energy. To summarize, results obtained for E.coli Purine Nucleoside Phosphorylase strongly suggest the importance of the two specific pairs of the aromatic amino acids: Phe159- Tyr160 or Tyr159-Tyr160 simultaneously indicating a crucial role of the π - π stacking in the formycin A binding. M. musculus thymidylate synthase Thymidylate synthase catalyzes N5,10-methylene-tetrahydrofolate (mTHF)-dependent methylation of dUMP C(5), producing 5,7-dihydrofolate (DHF) and thymidylate, with the total reaction involving apparently two component reactions: transfer of the mTHF methylene group and its reduction at the cost of tetrahydrofolate (THF). Previously described crystallographic structure (Dowiercia et al. Pteridines 24, 93-98, 2013) sug gested N4 -OH-dCMP, a slow-binding thymidylate synthase inhibitor, to cause an ap vi parent ”uncoupling” of the two component reactions, resulting in an irreversible en zyme self-inactivation due to the inhibitor C(5) reduction and covalent binding of C(6) to the active center cysteine residue. The latter prompted a hypothesis on the enzyme’s capacity to use THF as a cofactor reducing the dUMP pyrimidine ring C(5) in the ab sence of the 5-methylene group. In order to test this hypothesis, the present study con centrated on learning whether the time-dependent enzyme inhibition by N4 -hydroxy dCMP is accompanied by parallel THF to DHF oxidation reflected by the increase of the absorption at λ = 340 nm. Spectrophotometric results verified the mTHF-dependent N4 -OH-dCMP inhibition to be accompanied by DHF production that was time- and temperature-dependent and thus TS-catalyzed, as deduced previously based on the crystal structure (PDB ID: 4EZ8). Moreover, observation of the mixtures of mTS with THF (an intermediate of the full mTS reaction) and N4 -OH-dCMP or FdUMP (a strong TS inhibitor and active form of several chemotherapeutic drugs) also testified to the time-, temperature- and TS activity-dependent production of DHF, which is in accord with the hypothesis of the uncoupling of the mTS-catalyzed component reactions resulting from the mechanism based N4 -OH-dCMP inhibition. Further studies of the mechanism of TS inhibition by N4 -OH-dCMP involved two mTS mutant proteins, H190A and W103G. They were designed based on the TS crys tallographic structure involving the inhibitor bound in the active center. Each of the mutated amino-acid residues (H190 and W103) were selected as capable of hydrogen bonding with the N4 -OH substituent. Repeating the above mentioned spectrophoto metric studies testing DHF production in the course of mTHF/THF-dependent reac tion of each TS mutant with N4 -OH-dCMP/FdUMP confirmed the above presented findings. Results obtained during the spectral analysis of all of the enzymes (mTS, H190A and W103G) revealed an interesting observation. Tryptophan at position 103 has very unique spectral properties that influence the emission and fluorescence decay param eters of the whole mTS molecule. The elimination of this residue in the W103G mutant of mTS causes the emission maximum shift of 16 nm towards the shorter wavelengths. Multi-dimensional fluorescence with PARAFAC analysis confirmed that emission of the mTS is composed of two components (one in the short wavelength and the second in the long wavelength part of the emission spectrum). While for mTS and H190A the ratio between these two components is rather identical (domination of the long wavelength component), in the W103G mutant we observed that elimination of Trp103 causes a substantial change in this ratio in favour of the short-wavelength component. This indicated that the second component of the emission is mainly composed of the Trp103 fluorescence. Additional multi-wavelength time-resolved fluorescence measurements of all three enzymes alone and with dUMP (substrate), FdUMP and N4 -OH-dCMP confirmed the above results and testified to a probable very weak collisional interactions between W103G and all of the ligands. This indicated a legitimacy of using time-resolved flu orescence in verification of the mTS interactions. Furthermore, calculations of elec trostatic potential (E.P.) around tryptophan residues in mTS, showed a big negative difference in the E.P. in the benzene → pyrrole direction of the Trp103 residue, approx. 3-4 times larger than for other Trp residues in mTS (except Trp75), confirming Trp103 to play an important role in the mTS mechanism. As Trp103 closes the active site of the mTS, suggesting that the aspect of E.P. and its properties should be further investi gated. The presented doctoral dissertation shows that its objectives were successfully ac complished. The author showed the importance of the aromatic amino acid pair at the positions 159 and 160 of PNPr in the interactions of this enzyme with formycin A and proved the uncoupling of the TS reaction steps simultaneously proving that the utilization of emission spectroscopy methods is useful in the performed investiga tions. Obtained results may be useful in the improvement of the target chemotherapy. Additionally, the author showed a promising path for future analysis that uses the electrostatic potential calculations. |
| dc.abstract.en | Rozwój i osiągnięcia współczesnej medycyny dały ludzkości możliwość leczenia ˙ czy tez wyeliminowania chorób jeszcze niewiele lat temu nieuleczalnych. Ta niepowstrzymana ewolucja medycyny wydłuża oraz poprawia jakość życia ludzkiego. Niestety wszystko ma swoje złe oblicza. Razem z pozytywnymi aspektami wspomnianego rozwoju pojawiło się kolejne wyzwanie: rak. W populacjach krajów wysokorozwiniętych schorzenie to jest jedną z głównych przyczyn śmierci. Jednak wraz z rozwojem prac badawczych nad technikami leczenia bazującymi na wiedzy o kancerogenezie, jesteśmy w stanie leczyć lub nawet zapobiegać kolejnym fazom rozwoju nowotworów. Wśród wielu proponowanych metod można znaleźć transfekcje wybranym białkiem docelowym (”target protein”) komórek nowotworowych czy tez wykorzystanie niskocząsteczkowych inhibitorów enzymatycznych. W związku ze wspomnianymi metodami pozostaje temat prezentowanej dysertacji, a mianowicie mechanizm interakcji z ligandami dwóch enzymów (Fosforylazy Nukleozydów Purynowych i Syntazy Tymidylanowej), które pełnią niezwykle ważną rolę w recyklingu i syntezie ˙ DNA. Fosforylaza Nukleozydów Purynowych (PNP – ang. Purine Nucleoside Phosporylase) znajduje się na drodze odzysku zasad purynowych, ponownie wykorzystywanych do syntezy DNA. Enzym ten katalizuje reakcję odwracalnej fosforolizy (deoksy)rybonukleozydów prowadzącej do przecięcia wiązania glikozydowego między zasadą purynową oraz pentoz ˛a, wykorzystując do tego drugi substrat – fosforan. Syntaza Tymidylanowa (TS – ang. Thymidylate Synthase) z kolei katalizuje reakcję konwersji dUMP do dTMP, który inkorporowany jest do DNA. Niniejsza dysertacja przedstawia badania, którym przyświecały następujące cele: (i) analizę właściwości spektroskopowych molekularnych celów w terapiach przeciwnowotworowych - Fosforylazy Nukleozydów Purynowych z E. Coli (PNPr) oraz Syntazy Tymidylanowej z M. Musculus (mTS) i ich mutantów, a także (ii) spektroskopową ˙ charakterystykę interakcji wyżej wspomnianych enzymów oraz ich mutantów z wybranymi ligandami: formycyną A (z PNP) oraz dUMP, FdUMP i N4-OH-dCMP (z TS). Uściślając, w przypadku Fosforylazy Nukleozydów Purynowych z E. Coli celem było określenie (i) roli fenyloalaniny na pozycji 159 (Phe159) oraz tyrozyny na pozycji 160 (Tyr160) w oddziaływaniach z nukleozydami (formycyna A została użyta jako reprezentatywny nukleozyd) oraz (ii) rolę oddziaływań π - π między formycyną A, Phe159 i Tyr160. Co więcej, autorka zaplanowała weryfikację hipotezy o Ty160 będącej jedynym donorem energii dla formycyny A podczas zjawiska bezpromienistego przeniesienia energii (FRET-Förster Resonance Energy Transfer). Dodatkowym, drugoplanowym celem była charakterystyka właściwości spektroskopowych mutantów Fosforylazy Nukleozydów Purynowych z E. Coli: PNPF159Y (PNPY), PNPF159A (PNPA), PNPY160F (PNPF) i PNP160S (PNPS). Cele określone dla Syntazy Tymidylanowej z M. Musculus były następujące: (i) weryfikacja hipotezy o rozprzężeniu dwóch etapów reakcji katalizowanej przez enzym, ˙ towarzysz ˛acemu inhibicji powolnego wiązania przez N4 -OH-dCMP, (ii) określenie roli potencjału elektrostatycznego w interakcjach mTS z nukleotydami, oraz (iii) charakteryzacja właściwości spektroskopowych dwóch mutantów mTS: H190A oraz W103G. Fosforylaza Nukleozydów Purynowych z E. Coli. Wyniki uzyskane dla kompleksów PNPr oraz wymienionych wcześniej mutantów z formycyn ˛a A (FA) dowodzą, iż Phe159 oraz Tyr160 s ˛a kluczowymi w wiązaniu FA ˙ aminokwasami. Wszystkie wykorzystane w niniejszej dysertacji metody, spektroskopia absorpcyjna i fluorescencyjna, obliczenia stałych dysocjacji, obliczenia wydajności FRET oraz badania wpływu FA na komponenty zaniku fluorescencji wskazały na to, ze brak Phe159 (mutant PNPA) w znacznym stopniu obniża zdolność wiązania formycyny A do centrum aktywnego enzymu. Prezentowane tu wyniki sugeruj ˛a raczej kolizyjne wygaszanie fluorescencji PNPA przez FA. Niezwykle interesujące i zaskakujące wyniki zostały uzyskane dla mutanta PNPY (PNPF159Y, gdzie Phe jest zamieniona na Tyr), które były nie tylko związane z interakcjami z FA ale również z właściwościami spektroskopowymi wspomnianego enzymu. ˙ Badania dostarczyły dowodów na to, iż powstaje anion tyrozynowy (Tyr) jak również jego stan wzbudzony (Tyr∗), który silnie wpłynął na kształt widm absorpcji i emisji, na parametry zaniku fluorescencji (obecność dodatkowego komponentu) i dodatkowo spowodował w znacznym stopniu obniżenie wydajności FRET między PNPY oraz FA. ˙ Wyniki, mimo ze ukazały jedynie niewielki wzrost emisji FA w kompleksach z PNPY ˙ (w porównaniu do PNPr) świadczyły o tym, ze te obserwacje są najprawdopodobniej ˙ wynikiem prostopadłej orientacji momentów przejście donora (Tyr150/Tyr160) oraz akceptora energii (FA). Trzeba wspomnieć również że wyniki badań wskazały na to, że mutant PNPY ˙ silnie wiąże FA w centrum aktywnym, co plasuje go w roli obiecującego obiektu dalszych badań. Wyniki wskazały, że w tym aspekcie bardzo ważną rolę odgrywa Tyr160. ˙ Mutanty, które nie zawierały Tyr160 (PNPY160F raz PNPY160S) nie były w stanie formować stabilnych kompleksów z FA. Zarówno w przypadku absorpcyjnych, jak i fluorescencyjnych widm różnicowych nie znaleziono żadnych cech świadczących o oddziaływaniach statycznych, co sugerowało obserwację raczej kolizyjnego wygaszania emisji wspomnianych enzymów. Podsumowując, wyniki uzyskane dla Fosforylazy Nukleozydów Purynowych z E. Coli wyraźnie sugerują istotną rolę dwóch rodzajów par aminokwasowych w wiązaniu formycyny A, jednocześnie potwierdzając istotność oddziaływań π - π: Phe159- Tyr160, Tyr159-Tyr160. Syntaza Tymidylanowa z M. Musculus Syntaza Tymidylanowa katalizuje zalezną od N ˙ 5,10- metylenotetrahydrofolianu (mTHF) metylację C(5) w dUMP, prowadząc ˛a do powstania 5,7- dihydrofolianu (DHF) oraz tymidylanu. Reakcja ta wydaje się zawierać dwie części: transfer grupy metylenowej z mTHF oraz jej redukcję przy udziale THF. Wcześniejsze doniesienia krystalograficzne (Dowierciał et al. Pteridines 24, 93-98, 2013) sugerowały, ze wolno wiązany inhibitor TS, N4 -OH-dCMP moze powodować rozprzężenie tych dwóch komponentów reakcji, skutkując nieodwracalną inaktywacją enzymu w wyniku redukcji C(5) inhibitora oraz utworzonego wiązania kowalencyjnego między C(6) inhibitora i katalityczną cysteiną. W konsekwencji sformułowano hipotezę mówiącą o tym, ze enzym może˙ użyć THF jako redukującego dUMP kofaktora pod nieobecność grupy 5-metylenowej. ˙ Aby zweryfikować powyzszą hipotezę, prezentowane badania skoncentrowały się na ˙ sprawdzeniu czy podczas czasowo zależnej inhibicji mTS przez N 4 -OH-dCMP zachodzi oksydacja THF do DHF, która rejestrowana jest jako wzrost absorpcji przy długości fali λ = 340 nm. Tak jak wcześniej wydedukowano na podstawie struktury krystalograficznej (PDB ID: 4EZ8), wyniki uzyskane za pomoc ˛a spektroskopii absorpcyjnej wskazały na czasowo i temperaturo zależną produkcję DHF w reakcji mTS z mTHF oraz N ˙ 4 -OHdCMP. Co więcej, produkcję DHF również udało się zarejestrować dla mieszanin mTS ˙ z THF (pośrednim produktem reakcji) oraz z N4 -OH-dCMP lub z FdUMP (silnym inhibitorem TS, który jest również formą aktywną środków przeciwnowotworowych), ˙ co jest w zgodzie z hipotezą o rozprzeżeniu reakcji mTS, wynikającym z inhibicji przez ˙ N4 -OH-dCMP. W dalszych badaniach mechanizmu inhibicji (przez N4 -OH-dCMP) mTS wykorzystano dwa mutanty, H190A oraz W103G. Białka te zostały zaprojektowane na podstawie struktur krystalograficznych TS ze związanym w centrum aktywnym inhibitorem. Każda ze zmutowanych reszt aminokwasowych (H190 i W103) była wskazana jako reszta mogąca tworzyć wiązania wodorowe z podstawnikiem N4 -OH. W obu wypadkach wyniki spektroskopii absorpcyjnej potwierdziły zalezną od aktywności enzymu produkcję DHF w reakcjach z mTHF/THF oraz z N4 -OH-dCMP/FdUMP. Wyniki analizy wła´sciwości spektroskopowych wszystkich trzech enzymów (mTS, H190A i W103G) ujawniły interesującą obserwację. Tryptofan na pozycji 103 posiada bardzo nietypowe właściwości spektroskopowe, które wpływają na emisję oraz parametry zaniku fluorescencji całej cząsteczki mTS. Usunięcie tego tryptofanu w białku W103G powoduje przesuni˛ecie maksimum emisji o 16 nm w stronę fal krótszych. Pomiary wielowymiarowej fluorescencji (MDF – ang. Multi-dimentional fluorescence) połączone z analizą PARAFAC potwierdziły, ze emisja badanych enzymów składa się z dwóch komponentów (jednego w spektrum krótkich, drugiego w spektrum fal długich). Podczas gdy dla mTS i H190A stosunek obu komponentów emisyjnych jest wręcz identyczny (dominacja komponentu w spektrum fal długich), dla W103G eliminacja tryptofanu powoduje ogromną zmianę w tym stosunku na korzyść komponentu w spektrum fal krótkich. Ta obserwacja zasugerowała, ze na drugi komponent emisyjny składa się głównie emisja Trp103. Wyniki uzyskane za pomoc ˛a wielofalowej czasowo-rozdzielczej fluorescencji dla wszystkich trzech enzymów w roztworze oraz dla ich kompleksów z dUMP, FdUMP oraz N4 -OH-dCMP potwierdziły powyższe wyniki jak również wskazały na bardzo słabe, prawdopodobnie kolizyjne interakcje ligandów z W103G. Potwierdzono użyteczność czasowo-rozdzielczych metod w badaniu interakcji mTS. Co więcej, obliczenia potencjału elektrostatycznego wokół reszt tryptofanowych w mTS wskazały na dużą, negatywną różnicę potencjału w kierunku benzen ˙ → pyrol dla Trp103, która jest 3-4 razy większa niż w przypadku pozostałych tryptofanów (oprócz Trp75). Potwierdza to tym samym ważną rolę Trp103 w mechanizmie reakcji mTS. Biorąc pod uwagę ˙ rolę Trp103 w zamykaniu miejsca aktywnego mTS, aspekt E.P. powinien być poddany dalszym badaniom. Prezentowana praca doktorska demonstruje osiągnięcie zamierzonych celów. Wykazano istotną rolę aminokwasów aromatycznych na pozycjach 159 oraz 160 w interakcjach PNPr z formycyn ˛a A oraz dowiedziono rozprzęgnięcia reakcji katalizowanej przez mTS, jednocześnie prezentując przydatność spektroskopii emisyjnej w wykonywanych badaniach. Uzyskane wyniki mogą w przyszłości być przydatne w rozwoju chemioterapii. Dodatkowo, wyniki wskazują obiecującą ściezkę dalszych analiz wykorzystujących obliczenia potencjału elektrostatycznego. |
| dc.affiliation.department | Wydział Fizyki |
| dc.contributor.author | Prokopowicz, Małgorzata |
| dc.date.accessioned | 2023-10-10T07:10:04Z |
| dc.date.available | 2023-10-10T07:10:04Z |
| dc.date.defence | 2023-10-20 |
| dc.date.issued | 2023-10-10 |
| dc.description.additional | Link archiwalny https://depotuw.ceon.pl/handle/item/4701 |
| dc.description.promoter | Fita, Piotr |
| dc.description.promoter | Rode, Wojciech |
| dc.identifier.uri | https://repozytorium.uw.edu.pl//handle/item/4701 |
| dc.language.iso | en |
| dc.rights | ClosedAccess |
| dc.subject.en | time-resolved spectroscopy |
| dc.subject.en | sbsorption spectroscopy |
| dc.subject.en | fluorescence spectroscopy |
| dc.subject.en | THF |
| dc.subject.en | mTHF |
| dc.subject.en | N4-OH-dCMP |
| dc.subject.en | FdUMP |
| dc.subject.en | dUMP |
| dc.subject.en | formycin A |
| dc.subject.en | Purine Nucleoside Phosphorylase |
| dc.subject.en | Thymidylate Synthase |
| dc.subject.en | spektroskopia czasowo-rozdzielcza |
| dc.subject.en | spektroskopia absorpcyjna |
| dc.subject.en | spektroskopia fluorescencyjna |
| dc.subject.en | THF |
| dc.subject.en | mTHF |
| dc.subject.en | N4-OH-dCMP |
| dc.subject.en | FdUMP |
| dc.subject.en | dUMP |
| dc.subject.en | formycyna A |
| dc.subject.en | Forsforylaza Nukleozydów Purynowych |
| dc.subject.en | Syntaza Tymidylanowa |
| dc.title | Spectroscopic studies of interactions of molecular targets in chemotherapy: Purine Nucleoside Phosphorylase, Thymidylate Synthase and their mutants with specific ligands |
| dc.title.alternative | Badania Spektroskopowe interakcji celów w chemioterapii: Fosforylazy Nukleozydów Purynowych, Syntazy Tymidylanowej oraz ich mutantów ze specyficznymi ligandami |
| dc.type | DoctoralThesis |
| dspace.entity.type | Publication |